一种硫堇修饰抗体及其制备方法与应用与流程

本发明属于抗原检测，具体涉及一种硫堇修饰抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、电化学免疫传感器是一种基于电化学原理的生物传感器，用于检测生物分子(如蛋白质、抗原、抗体等)。在使用电化学免疫传感器进行检测分析时，样品中的目标分子与生物识别层发生特异性结合。随后，通过施加适当的电位或电流，触发电化学反应，并测量产生的电化学信号。根据信号的强度，可以推断出目标分子的浓度或存在与否。基于免疫反应的特异性和电化学信号的灵敏度，电化学免疫传感器实现对目标分子的快速、准确、敏感的定量检测和分析，具有灵敏度高、特异性好、成本低等优点。

2、当前，传统的电化学免疫检测方法广泛应用于医学诊断、生物科学研究和环境监测等领域。但是，对于单抗配置的电化学免疫传感器，可能与其他分子或类似结构的物质发生交叉反应，引起假阳现象。并且单抗配置的电化学免疫传感器的检出限较高，灵敏度较低。如zhao等1提出的基底电极表面修饰石墨烯-壳聚糖复合物，以k3fe(cn)6为探针，检测三聚氰胺的含量，最终达到0.2ng/ml的检出限。因此，采用双抗配置的电化学免疫传感器，可减少不必要的假阳现象且会达到更高的灵敏度。但是在众多的双抗配置中，修饰检测抗体(ab2)的步骤是十分复杂的，可能在操作过程中导致抗体的降解和失活，将会导致传感器性能下降。

3、(1)赵波；陈昌云；邵科峰；颜妍.测定三聚氰胺含量的电化学免疫传感器及制备方法和应用,october 30,2013.https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v＝vdpasdvfhvtjfiknuer274gvicbzdjvasdkqlkfkvhdvfutvielqzd9u0py7z4rejz1phrsyoyquggbx8uupa5holyex bfls2fw0vcdyhx6i0-ff_s4kpearmpwx1uenkgcvkdvohwe＝&uniplatform＝nzkpt&langua ge＝chs(accessed 2024-01-08).

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种硫堇修饰抗体的制备方法。

2、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的制备方法得到的硫堇修饰抗体。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第二方面的硫堇修饰抗体的应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种检测抗原的试剂盒。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种检测抗原的系统。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种检测抗原的方法。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供一种硫堇修饰抗体的制备方法，将第一抗体进行羧基活化，然后将得到的羧基活化的第一抗体与硫堇(thi)偶联，得到硫堇修饰抗体。

9、优选地，所述制备方法包括如下步骤：将第一抗体溶液与羧基活化试剂溶液进行第一次混合，得到第一混合液；将第一混合液与硫堇进行第二次混合，进行偶联反应，得到硫堇修饰抗体。

10、优选地，所述硫堇与所述第一抗体的摩尔比为1:(40～100)；进一步为1:(60～100)；更进一步为1:(75～100)；再进一步为1:(75～85)。

11、优选地，所述羧基活化试剂为edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、edc和nhs(n-羟基丁二酰亚胺)、dcc(1，3-二环己基碳二亚胺)或dic(n,n'-二异丙基碳二亚胺)；进一步为edc和nhs。

12、优选地，所述edc和nhs的质量比为1：(0.5～1.5)；进一步为约1:1。

13、优选地，所述第一抗体与羧基活化试剂的质量比(即第一抗体溶液与羧基活化试剂溶液中的第一抗体与羧基活化试剂的质量比)为1:(5～30)；进一步为1:(15～30)；更进一步为1:(15～25)；再进一步为约1:20。

14、优选地，所述羧基活化试剂溶液的溶剂为缓冲液，所述缓冲液的ph为4～6.5。

15、优选地，所述羧基活化试剂溶液中的缓冲液的ph为4.5～5.5；进一步为约5。

16、优选地，所述羧基活化试剂溶液中的缓冲液为mes缓冲液、pbs缓冲液中的至少一种；进一步为mes缓冲液。

17、优选地，所述第一抗体溶液的溶剂包含水(优选无酶水)、pbs缓冲液、pb缓冲液中的至少一种；进一步为pbs缓冲液。

18、优选地，所述第一抗体溶液中的pbs缓冲液、或pb缓冲液的ph为7.0～7.6。

19、优选地，所述第一抗体溶液中的pbs缓冲液、或pb缓冲液的ph为约7.4。

20、优选地，所述第一抗体溶液与羧基活化试剂溶液的体积比为1:(0.5～1.5)；进一步为1:(0.8～1.2)；更近一步为约1:1。

21、优选地，所述偶联反应的时间为1～6h；进一步为2～6h；更进一步为3～6h；再进一步为3.8～5h；最优选为约4h。

22、优选地，所述第一次混合的时间为15～45min；进一步为20～40min；更进一步为25～35min；再进一步为约30min。

23、优选地，所述第一次混合的温度为32～42℃；进一步为35～39℃。

24、优选地，所述第一次混合通过震荡混合；进一步通过450～850rpm下震荡混合。

25、优选地，所述偶联反应的温度为32～42℃；进一步为35～39℃。

26、优选地，所述偶联反应在震荡条件下进行；进一步在450～850rpm的震荡条件下进行。

27、优选地，所述偶联反应之后还包括纯化的步骤。

28、优选地，所述纯化具体为洗涤。

29、优选地，所述洗涤为离心洗涤；进一步在超滤管中进行离心洗涤。

30、优选地，所述超滤管为约50kda的超滤管。

31、优选地，所述离心的条件为5000～10000rpm离心4～6min。

32、优选地，所述硫堇修饰抗体用于检测抗原。

33、优选地，所述第一抗体特异性结合所述抗原。

34、优选地，所述第一抗体为检测抗体。

35、优选地，所述抗原包含心肌肌钙蛋白i、il-6、tnf-alpha中的至少一种。

36、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的制备方法得到的硫堇修饰抗体。

37、本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面的硫堇修饰抗体在a1)～a2)任一项中的应用：

38、a1)非诊断目的地检测抗原；

39、a2)制备检测抗原的产品；

40、所述硫堇修饰抗体中的第一抗体特异性结合所述抗原。

41、优选地，所述抗原包含心肌肌钙蛋白i、il-6、tnf-alpha中的至少一种。

42、优选地，所述产品包含试剂盒、系统中的至少一种。

43、本发明的第四个方面，提供一种检测抗原的试剂盒，包含本发明第一个方面的硫堇修饰抗体。

44、优选地，所述试剂盒还包含电化学免疫传感器。

45、优选地，所述电化学免疫传感器包含工作电极，所述工作电极的表面依次修饰有半胱胺盐酸盐、戊二醛、第二抗体和封闭剂；所述第二抗体特异性结合所述抗原，并且所述第二抗体的抗原表位不同于所述第一抗体的抗原表位。

46、优选地，所述第二抗体为捕获抗体。

47、优选地，所述封闭剂包含甘氨酸、精氨酸、bsa、乙醇胺中的至少一种；进一步为乙醇胺和bsa。

48、优选地，所述电化学免疫传感器的制备方法如下：将电化学免疫传感器的工作电极与半胱胺盐酸盐接触，进行第一次反应；然后将所述电化学免疫传感器的工作电极与戊二醛接触，进行第二次反应；接着将所述电化学免疫传感器的工作电极与第二抗体接触，进行第三次反应；最后将所述电化学免疫传感器的工作电极与封闭剂接触，进行第四次反应。

49、优选地，所述第一次反应的条件为0～6℃下反应1～3h；进一步为冰上反应1～3h。

50、优选地，所述第二次反应的条件为0～6℃下反应1～3h；进一步为冰上反应10～20min。

51、优选地，所述第三次反应的条件为0～6℃下反应1～3h；进一步为冰上反应1～3h。

52、优选地，所述第四次反应具体为：将所述电化学免疫传感器的工作电极与乙醇胺在0～6℃下反应10～20min，然后将所述电化学免疫传感器的工作电极与bsa在0～6℃下反应10～20min。

53、优选地，所述第四次反应具体为：将所述电化学免疫传感器的工作电极与乙醇胺在冰上反应10～20min，然后将所述电化学免疫传感器的工作电极与bsa在冰上反应10～20min。

54、优选地，所述第四次反应之后还包括洗涤的步骤。

55、优选地，所述第一次反应、第二次反应、第三次反应和/或第四次反应在黑暗条件下进行。

56、优选地，所述工作电极表面修饰有金；进一步修饰有金纳米颗粒。

57、优选地，所述工作电极包含碳电极、玻碳电极、铂电极、金电极、银电极、铅电极、和导电玻璃中的至少一种。

58、优选地，所述电化学免疫传感器还包含参比电极、和对电极。

59、优选地，所述抗原包含心肌肌钙蛋白i、il-6、tnf-alpha中的至少一种。

60、本发明的第五个方面，提供一种检测抗原的系统，包含电化学工作站和本发明第四个方面的试剂盒。

61、优选地，所述抗原包含心肌肌钙蛋白i、il-6、tnf-alpha中的至少一种。

62、本发明的第六个方面，提供一种非诊断目的地检测抗原的方法，包含采用本发明第二个方面的硫堇修饰抗体、本发明第四个方面的试剂盒和/或本发明第五个方面的系统的步骤。

63、优选地，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第二个方面的硫堇修饰抗体混合，得到的混合液加入电化学免疫传感器中，反应，然后检测电化学信号。

64、优选地，所述电化学免疫传感器为本发明第四个方面中的电化学免疫传感器。

65、优选地，所述反应的时间为0.5～1.5h。

66、优选地，所述反应的温度为室温。

67、优选地，所述反应之后还包含洗涤的步骤。

68、优选地，所述洗涤采用pbs缓冲洗涤。

69、优选地，所述检测在pbs缓冲液中进行。

70、优选地，所述抗原包含心肌肌钙蛋白i、il-6、tnf-alpha中的至少一种。

71、优选地，所述待测样品选自待测对象的体液、组织、细胞、排泄物中的至少一种；进一步为体液。

72、优选地，所述体液包含血液、淋巴液、胸水、脑脊液、关节液、腹水、唾液、淋巴液、体内积液中的至少一种；进一步为血液。

73、优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种；进一步为血清。

74、优选地，所述排泄物包含尿液、粪便、泪液、汗液中的至少一种。

75、优选地，所述受试样品选自待测对象的血清。

76、优选地，所述待测对象包含哺乳动物，例如人类、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。

77、优选地，所述待测对象包含人类。

78、本发明的有益效果是：

79、本发明提供了一种硫堇修饰抗体的制备方法，该方法通过将多个thi修饰在抗体的多个位点上，能够增强电化学信号产生的效果，从而提高检测的灵敏度和可靠性；并且该thi修饰抗体技术还简化了实验步骤和操作流程，减少了操作步骤和时间成本，提高了实验效率，提高了检测的便捷性和效率，具有较高的实用性和可行性；同时，抗体与目标分子之间的高度特异性结合保证了免疫检测的准确性和特异性，从而使得硫堇修饰抗体作为电化学免疫检测的关键组分具有较高的特异性和亲和力，能够增强分子与抗体的结合效果，从而提高检测的准确性和特异性，可广泛应用于医学诊断、药物研发和环境监测等领域。