本发明涉及基因编辑的，具体涉及一种包含nb237的融合蛋白、包含该蛋白的基因表达沉默工具及其应用。
背景技术：
：：1、crispr/cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。crispr/cas系统可以识别出外源dna，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中rna干扰(rnai)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，crispr/cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。2、基于crispr-cas的基因编辑技术使编辑人类基因组变得简单及高效，但是基于crispr-cas进行基因编辑时会造成dna双链断裂，影响基因组的完整性。在crispr-cas基础上开发的碱基编辑工具或先导编辑工具可以精确修复致病突变，但需要在dna上造成一个或多个单链切口，同样需要细胞内源dna修复机制完成编辑过程，因此容易引入目的修复之外的有害突变。而且由于改变了dna序列，以上编辑过程不可逆。而基于表观遗传的基因编辑工具能够在不造成dna序列改变的前提下通过改变目的基因附近相关的表观状态，进而调控基因表达。表观遗传的基因编辑是可逆的，不需要dna断裂，不改变dna序列，能够有效避免基因编辑造成的细胞毒性。3、目前的可编程表观基因组编辑技术通常依赖于cas9融合蛋白的组成型表达来维持转录控制。因此，这些方式仍然不适合治疗性细胞和生物工程。为了构建一个可以模仿天然dna甲基化的表观遗传编辑器，研究人员创建了一个微型蛋白质机器，该机器在小rna的引导下可以将甲基粘在链上的特定位点。这些甲基化的基因随后被沉默或关闭，因此得名crisproff(james ket al.,genome-wide programmable transcriptionalmemory by crispr-based epigenome editing,cell.2021apr 29；184(9):2503-2519.e17.doi:10.1016/j.cell.2021.03.025.epub 2021apr 9.)。4、基于表观遗传编辑的基因沉默工具能够在保持dna序列不变的情况下通过对dna或组蛋白的化学修饰抑制目的基因的表达，相对传统的基因编辑工具表现出更高的安全性和灵活性。基础研究方面可用于探究目的基因的功能，临床应用方面可以特异性的抑制致病基因的表达，达到疾病治疗的目的，具有广阔的应用前景。5、目前基于表观遗传的基因沉默工具主要依靠两个家族的效应蛋白，分别为krab(krüppel-associated box)及dna甲基转移酶((dna methyltransferase，dnmts)。dcas9引导krab结构域到目的dna附近，krab招募表观沉默因子对组蛋白进行化学修饰(angeloamabile et al.,inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-runtargeted epigenetic editing,cell.2016 sep 22；167(1):219-232.e14.doi:10.1016/j.cell.2016.09.006.)，改变染色质状态从而达到基因沉默目的，不过krab对基因表达沉默的效果是瞬时的，细胞内转入的外源krab表达消失之后目的基因表达很快恢复到沉默前水平。dnmts对目的基因的启动子进行甲基化，阻碍转录因子等与启动子的结合，从而达到基因沉默的目的，而且甲基化状态可以随细胞分裂而遗传，达到长期沉默的目的，不过单纯的dnmts对基因表达沉默的效果有限。因此，有研究将dnmts与krab结合，构建dcas9-dnmts-krab融合蛋白即crisproff，达到长期、高效基因沉默的目的(james ket al.,genome-wide programmable transcriptional memory by crispr-based epigenomeediting,cell.2021 apr 29；184(9):2503-2519.e17.doi:10.1016/j.cell.2021.03.025.epub 2021 apr 9.)。6、然而，利用现有的crisproff进行基因沉默时也存在一些问题，如沉默效果依赖于grna的选择，而且通常基因沉默是不完全的(nader alerasool et al.,an efficientkrab domain for crispri applications in human cells,nat methods.2020 nov；17(11):1093-1096.doi:10.1038/s41592-020-0966-x.epub 2020 oct 5.)。因此，寻找krab及dnmts这两个家族之外的表观效应因子或许能帮助突破现有crisproff工具的局限性，推动crisproff工具进一步的临床应用。7、纳米抗体(nanoantibody)是指缺失抗体轻链而只含单个重链可变区的一类抗体，与完整抗体一样，其可以选择性的和特定抗原结合。因只含单个重链可变区，所以相对完整抗体而言纳米抗体的尺寸大大减小，分子量只有传统抗体的10％左右，仅约100个氨基酸，但保留了完整的抗原结合能力，纳米抗体的特异性强、亲和性好、稳定性高，广泛用于生化机制研究及肿瘤治疗领域等。8、三结构域蛋白(tripartite motif-containing protein，trim)家族由80多个具有e3泛素连接酶活性的蛋白组成，根据trim蛋白结构的不同，将其分为11个亚家族，其中最多的是c-iv亚家族成员，其包含的trim蛋白有33个。三结构域蛋28(trim28)是trimc-iv家族的一个重要成员，含有e3泛素连接酶和ring锌指结构，近年来被发现是重要的肿瘤相关调节因子。trim28在多种恶性肿瘤中表达明显升高，与临床病理特征密切相关，并在肿瘤的发生、侵袭转移、拮抗凋亡以及化疗耐药过程中发挥重要作用，可能是肿瘤临床诊断和预后评判的标志和靶点。9、nb237是一种靶向trim28的纳米抗体，trim28是一种转录中间因子，通过调控多种转录因子的转录活性来控制基因的表达，研究表明trim28可以通过介导异染色质形成抑制基因表达(aporcnik et al.,，trim28 selective nanobody reduces glioblastoma stemcell invasion,molecules.2021 aug 25；26(17):5141.doi:10.3390/molecules26175141.和smitha p sripathy et al.,the kap1 corepressor functionsto coordinate the assembly of de novo hp1-demarcated microenvironments ofheterochromatin required for krab zinc finger protein-mediatedtranscriptional repression,mol cell biol.2006 nov；26(22):8623-38.doi:10.1128/mcb.00487-06.epub 2006 sep 5.)。nb237可以特异性的结合trim28，因此推测nb237或许可以通过与trim28的相互作用起到基因调控的目的。技术实现思路1、发明要解决的问题2、基于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于np237的基因表达沉默工具，构建了一种新型crisproff系统，并验证了该系统对真核细胞内dna表达沉默的效果。3、用于解决问题的方案4、本发明鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入研究、反复试验，将靶向trim28的纳米抗体nb237与dna甲基转移酶(dnmts)进行融合，构建了新型的基因表达沉默工具(dcas9-dnmts-np237)，从而完成了本发明。即本发明如下所述：5、[1]本发明的第一方面提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从n末端至c末端包含：dna甲基转移酶(dnmts)、xten接头、核酸酶缺陷型rna引导的dna核酸内切酶和nb237纳米抗体蛋白。6、在一些实施方案中，，其中所述dna甲基转移酶为dnmt3a和dnmt3l的融合蛋白；7、在一些优选的实施方案中，所述融合蛋白为由氨基酸序列如seq id no：7所示的dnmt3a蛋白和由氨基酸序列如seq id no：8所示的dnmt3l蛋白组成的融合蛋白。8、在一些实施方案中，其中所述xten接头包括与seq id no：9所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；9、在一些优选的实施方案中，所述xten接头的氨基酸序列如seq id no：9所示。10、在一些实施方案中，其中所述核酸酶缺陷型rna引导的dna核酸内切酶选自由以下组成的组中的任一种：dcas9、dcas12a、dcpf1、cas-phi、螺旋-转角-螺旋基序、螺旋-环-螺旋结构域、hmb-框结构域、wor3结构域、ob-折叠结构域、免疫球蛋白结构域或b3结构域；11、在一些优选的实施方案中，所述核酸酶缺陷型rna引导的dna核酸内切酶是dcas9；12、在一些更优选的实施方案中，所述核酸酶缺陷型rna引导的dna核酸内切酶包括与seq id no：10所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；13、在一些最优选的实施方案中，所述核酸酶缺陷型rna引导的dna核酸内切酶的氨基酸序列如seq id no：10所示。14、在一些实施方案中，其中所述nb237纳米抗体蛋白的氨基酸序列如seq id no：11所示。15、在一些实施方案中，其中所述融合蛋白进一步包括核定位信号(nls)肽和融合蛋白linker；优选的，所述融合蛋白linker的氨基酸序列如seq id no：12所示。16、[2]本发明的第二方面提供了一种多核苷酸，其编码如本发明的第一方面中所述的融合蛋白。17、[3]本发明的第三方面提供了一种载体，其包含如本发明的第二方面中所述的多核苷酸。18、[4]本发明的第四方面提供了一种细胞，其包含如本发明的第三方面中所述的载体。19、[5]本发明的第五方面提供了一种crisproff基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包含：20、(i)如本发明第一发明中所述的融合蛋白、如本发明第二方面中所述的多核苷酸或者如本发明第三方面中所述的载体；和，21、(ii)sgrna质粒。22、在一些实施方案中，其中所述sgrna质粒为靶向甲基化敏感型启动子或非甲基化敏感型启动子的sgrna质粒；23、在一些优选的实施方案中，所述甲基化敏感型启动子为印迹基因启动子，所述非甲基化敏感型启动子为选自由ef1α启动子、cmv启动子、cag启动子、cbh启动子、sv40启动子组成的组中的任一种；24、在一些更优选的实施方案中，所述甲基化敏感型启动子为snrpn启动子，所述非甲基化敏感型启动子为ef1α启动子；25、在一些最优选的实施方案中，所述sgrna质粒包含u6启动子、靶向snrpn启动子或ef1α启动子的序列和spcas9对应的scaffold序列。26、[6]本发明的第六方面提供了一种抑制目的蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括将稳定表达目的蛋白的细胞系瞬时转染如本发明第三方面中所述的载体和sgrna质粒；27、其中，所述稳定表达目的蛋白的细胞系为通过重组慢病毒载体感染hek293t细胞得到的稳定表达目标蛋白的细胞系，所述sgrna质粒为靶向甲基化敏感型启动子或非甲基化敏感型启动子的sgrna质粒；28、在一些优选的实施方案中，所述重组慢病毒载体在其整合区域从5’端到3’端依次包含：5’ltr、甲基化敏感型启动子或非甲基化敏感型启动子、目的蛋白编码框、ires、抗性筛选标记、wpre元件和3’ltr；29、在一些更优选的实施方案中，所述甲基化敏感型启动子为snrpn启动子，所述非甲基化敏感型启动子为ef1α启动子。30、[7]本发明的第七方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面中所述的融合蛋白、如本发明第二方面中所述的多核苷酸、如本发明第三方面中所述的载体或者如本发明第五方面中所述的crisproff基因编辑系统，以及药学上可接受的载体。31、[8]本发明的第八方面提供了一种如本发明的第一方面中所述的融合蛋白、如本发明的第二方面中所述的多核苷酸、如本发明的第三方面中所述的载体或者如本发明的第五方面中所述的crisproff基因编辑系统在制备表观遗传基因沉默药物中的用途。32、[9]本发明的第九方面提供了一种如本发明的第一方面中所述的融合蛋白、如本发明的第二方面中所述的多核苷酸、如本发明的第三方面中所述的载体或者如本发明的第五方面中所述的crisproff基因编辑系统在制备治疗靶向trim28的疾病的药物中的用途；33、在一些优选的实施方案中，所述靶向trim28的疾病为选自以下疾病中的任一种：胃癌、乳腺癌、直肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和非小细胞肺癌。34、发明的效果35、由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：36、本发明在甲基化敏感型启动子(snrpn)和非甲基化敏感型启动子(ef1α)启动的egfp上验证新型crisproff工具的基因沉默效果。相对于dcas9-dnmts而言，融合了nb237的新型crisproff系统(即dcas9-dnmts-np237)在不同类型启动子(特别是非甲基化敏感型启动子snrpn)上能更加高效的抑制egfp的表达，基因沉默的效率提高了数倍以上，而且基因沉默的效果可以长期维持。因此，nb237可作为一种新型表观遗传基因沉默效应因子，为基于表观遗传的基因沉默提供更多选择，也为开发更为高效的表观遗传基因沉默工具奠定基础，助力表观遗传基因沉默工具的临床开发和应用。当前第1页12当前第1页12