一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用的制作方法

本公开涉及病毒载体的，具体涉及一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)载体作为一种领先的基因治疗载体，在科学研究和预临床/临床研究有广泛应用。尽管近年来通过自然发现，理性设计和定向进化等手段发现了一些具有前景的载体，如ken y chan等提供的aav php.eb载体，

2、(engineered aavs for efficient noninvasive gene delivery to thecentral and peripheral nervous systems，pmid:28671695)，该载体可高效通过血脑屏障，更有效地将基因输送到大脑细胞中。但是非靶向组织(如肝脏)的富集仍然是一个亟待解决的问题。同时，尽管以aav9为骨架进行改造的突变体如aav-9p31(rapid evolution ofblood-brain-barrier-penetrating aav capsids by rna-driven biopanning，pmid:33553485)和myoaav(directed evolution of a family of aav capsid variantsenabling potent muscle-directed gene delivery across species，pmid:34506722)发现在小鼠中枢神经系统和非人灵长类肌肉组织具有靶向性和转导能力，但是考虑到aav9和aav2蛋白序列的相似性(>80％)，针对aav9衣壳的预存抗体(preexisting antibody)可能广泛存在于人体内，从而限制了相关aav血清型的转化应用。

3、l.h.范登贝格最近发现了aav9衣壳蛋白(capsid protein，cap)在266位的氨基酸g→a突变或者在266位的氨基酸g→a突变加上在268位的氨基酸s→t突变会显著降低aav9在肝脏的富集，同时仍然保持类似的骨骼肌和心肌转导能力(例如参见：us20230051611a1；wo2022150634a2；wo2021050614a2；和in202217014261a)。同时l.h.范登贝格指出这一区域的序列保守性和这一区域可能作为与多数aav相关的粘附受体(attachment receptor)(又称为腺相关病毒受体，aavr)的界面从而影响aav组织嗜性(即组织特异性)的改变。但是目前没有实验数据证明该区域是否能够影响其它aav血清型的组织嗜性。这一aav-aavr结合区域以及其中的机制是否可以用于解释，甚至改造aav的组织靶向性仍不清楚。

4、作为序列最为多样的血清型之一，aav5被认为是血清中和抗体存在最少的血清型(global seroprevalence of pre-existing immunity against aav5 and other aavserotypes in people with hemophilia a，pmid:35156839)，也因此在近来的载体开发逐渐受到关注。同时，aav5-aavr结合模式与其它主流血清型也有很大差异(divergentengagements between adeno-associated viruses with their cellular receptoraavr，pmid:31434885)。

技术实现思路

1、发明要解决技术问题

2、基于现有技术中存在的上述问题，本公开提供了能够靶向骨骼肌的重组aav，利用本公开提供的重组aav能能够提高aav在骨骼肌的靶向性、降低aav在肝脏组织的腹肌。

3、用于解决问题的方案

4、本公开鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入研究、反复试验，基于aav5独特的序列特征和aav5-aavr结合模式，根据aav5与aavr相互作用的机制，通过对aav5的改造，改变了aav5组织靶向性。具体来说，本公开通过对aav5的衣壳蛋白与aavr的接触界面进行改造，分别产生aa5-gasn和aav5-gast突变体。即本公开如下所述：

5、[1].一种腺相关病毒(aav)衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白包含：(i)与seq id no：4的氨基酸序列至少80％相同并且在seq id no：4的g257位置后具有插入突变的序列，或者(ii)与seq id no：4的氨基酸序列至少80％相同并且在seq id no：4的g257位置和s258的位置后均具有插入突变的序列。

6、[2].根据[1]所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中(i)中所插入突变为在seq id no：4的g257位置后具有丙氨酸的插入突变。

7、[3].根据[1]所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，(ii)中所插入突变为在seq idno：4的g257位置后具有丙氨酸的插入突变，并且在seq id no：4的s258位置后具有苏氨酸的插入突变。

8、[4].根据[1]～[3]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其包含与seq id no：4的氨基酸序列至少95％相同的序列。

9、[5].根据[1]～[4]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其氨基酸序列分别如seq id no：5和seq id no：6所示。

10、[6].根据[1]～[5]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，腺相关病毒选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、rh.10、rh.39、rh.43和rh.74中的一种或多种；

11、在一些优选的实施方案中，aav包括aav5。

12、[7].一种多核苷酸，其编码[1]～[6]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

13、在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸的序列分别如seq id：2和seq id no：3所示。

14、[8].一种腺相关病毒，其包含[1]～[6]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

15、在一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性；

16、在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌为长收肌或股内侧肌。

17、[9].一种转基因递送载体，其包括如[8]所述的腺相关病毒。

18、[10].一种药物组合物，其包含：

19、(a)如[8]所述的腺相关病毒、或如[9]所述的转基因递送载体；以及，可选的，

20、(b)药学上可接受的载体。

21、[11].如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物在制备用于递送转基因至细胞的试剂中的用途。

22、[12].根据[11]所述的用途，其中，所述细胞来自受试者；

23、在一些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者；

24、在一些更优选的实施方案中，所述受试者是人。

25、[13].根据[11]或[12]所述的用途，其中，所述细胞来自骨骼肌。

26、[14].根据[12]或[13]所述的用途，其中，所述受试者患有骨骼肌疾病；

27、在一些优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

28、[15].根据[11]～[14]任一项中所述的用途，其中，所述腺相关病毒、所述转基因递送载体、或所述药物组合物通过肌肉注射来施用至受试者。

29、[16].如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途；

30、在一些优选的实施方案中，所述疾病包括骨骼肌疾病；

31、在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

32、[17].一种疾病治疗方法，其包括将如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物施用至受试者的步骤；

33、在一些优选的实施方案中，所述的疾病包括骨骼肌疾病；

34、在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

35、发明的效果

36、本公开提供的腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒，具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性，可作为递送载体用于骨骼肌相关疾病的治疗。对拓展aav相关的基因治疗具有重要作用。