一种酶突变体、级联催化合成手性S-4-芳基噁唑烷酮的方法和应用

本发明属于生物，尤其是一种酶突变体、醇脱氢酶突变体及与卤醇脱卤酶级联催化合成手性s-4-芳基噁唑烷酮的方法和应用。

背景技术：

1、噁唑烷酮是一类含氧、氮的五元杂环化合物，常被用作杀菌剂、抗微生物剂，还是一类价值极高的药物中间体，可作为β-氨基酸的前体，在医学上具有广泛应用。其最早于1981年被报道，这之后越来越多的手性4-取代和4,5-取代-2-噁唑烷酮类化合物被用作手性助剂，在抗菌、抗哮喘、免疫抑制剂等方面有了临床有效性验证。利奈唑胺就是一种具有强抑菌作用的药物。其中s构型的4-芳基噁唑烷酮可以合成抗高胆固醇药物依折麦布，也是k-阿片受体激动剂cj-15161的关键中间体，具有很大利用价值。噁唑烷酮类抗生素是一类结构新颖的全合成类抗生素，主要作用于细菌合成蛋白质的初始阶段。因其独特的作用机制，在对抗革兰氏阳性菌方面有很强的抗菌活性，同时很少存在交叉耐药性问题，所以一直被人们广泛关注。

2、目前，手性噁唑烷酮及其衍生物的合成方法主要有化学法和生物法。以手性醇为原料进行化学环化具有危险系数高，造价昂贵等缺点，且对反应温度有较为严苛的限制，需要较长的反应时间。使用生物法合成手性噁唑烷酮类化合物主要包括p450单加氧酶及卤醇脱卤酶催化环氧化物开环。p450单加氧酶法，由rudi fasan在2015年被报道，细胞色素p450酶可以有效地促进羰基叠氮酸底物的活化和环化，通过分子内氮烯c-h插入反应产生噁唑烷酮。然而这种方法获得的产物造价高昂，有较多副产物产生。而利用卤醇脱卤酶生成5-噁唑烷酮早在2008年就有报道，elenkov利用氰酸盐作为亲核试剂测试发现在卤醇脱卤酶作用下，开环产物会迅速环化成2-噁唑烷酮，这种方法中是在β位点进攻开环，生成5-噁唑烷酮。直到2019年陈永正等首次报道利用环氧苯乙烷为底物，氰酸酯为亲核试剂，使用野生型hheg合成4-芳基噁唑烷酮，然而生成产物的立体选择性不高，区域选择性较差。2022年周传华对abhheg进行改造，成功获得具高区域选择性，ee值为99％的r-4-芳基噁唑烷酮，并在对位、间位取代基的底物中得到很好的应用(e>200)，但是一方面直接利用卤醇脱卤酶合成s-4-芳基噁唑烷酮还鲜有报道，另一方面直接利用卤醇脱卤酶催化合成手性噁唑烷酮，其得率最高只有50％，原子经济性不高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种酶突变体、醇脱氢酶突变体及与卤醇脱卤酶级联催化合成手性s-4-芳基噁唑烷酮的方法和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种提高酶活的酶突变体，所述酶突变体为醇脱氢酶突变体和/或卤醇脱卤酶突变体，所述醇脱氢酶突变体在seq id no.1所示原始醇脱氢酶的序列中r位进行组合突变，所述r位为r1位、r2位、r3位和r4组合，所述r1位为第62位苯丙氨酸，r2位为第91位色氨酸、r3位为第209位赖氨酸、r4位为第249位丙氨酸：

4、i：使第62位的苯丙氨酸突变为谷氨酸；

5、ii：使第91位的色氨酸突变为苏氨酸；

6、iii：使第209位的赖氨酸突变为精氨酸；

7、iv：使第249位的丙氨酸突变为丝氨酸；

8、或者，所述卤醇脱卤酶突变体为在seq id no.5所示原始卤醇脱卤酶的序列中第103位的亮氨酸突变为甘氨酸。

9、进一步地，所述原始醇脱氢酶来源于pyrococcusfuriosus，命名pfadh，原始的核苷酸序列为seq id no.2所示；

10、或者，所述醇脱氢酶突变体具备seq id no.3所示的氨基酸序列；

11、所述卤醇脱卤酶为来源于ilumatobacter coccineus的卤醇脱卤酶突变体hheg(l103g)，所述卤醇脱卤酶原始酶核苷酸序列如seq id no.6所示；

12、所述卤醇脱卤酶突变体氨基酸序列如seq id no.7所示，所述卤醇脱卤酶突变体核苷酸序列如seq id no.8所示。

13、如上所述的述酶突变体的编码基因，所述编码基因为seq id no.4所示。

14、携带如上所述的基因的重组质粒。

15、作为优选，所述重组质粒的表达载体是pet28a(+)，所述表达宿主是e.coli bl21(de3)。

16、一种表达如上所述的基因的基因工程菌。

17、如上所述的述酶突变体在手性s-4-芳基噁唑烷酮合成中的应用。

18、一种醇脱氢酶突变体及与卤醇脱卤酶级联催化合成手性s-4-芳基噁唑烷酮的方法，包括如下步骤：

19、所述醇脱氢酶和卤醇脱卤酶以重组细胞、粗酶液的形式存在进行催化；

20、其中，所述醇脱氢酶和卤醇脱卤酶如以重组细胞的形式存在进行催化时，醇脱氢酶和卤醇脱卤酶的用量为10-100mg湿细胞/ml；

21、所述醇脱氢酶和卤醇脱卤酶以粗酶液形式存在进行催化时，反应体系中醇脱氢酶和卤醇脱卤酶的终浓度为10-30g/l；

22、催化反应的温度为25-35℃，催化反应的时间为2-48h。

23、进一步地，以重组细胞、粗酶液的形式存在的醇脱氢酶和卤醇脱卤酶的制备方法如下：

24、在宿主细胞中表达醇脱氢酶或卤醇脱卤酶，得到重组细胞；或者，向宿主细胞导入能够表达醇脱氢酶或卤醇脱卤酶的核酸分子，经诱导表达后，得到重组细胞；

25、裂解所述重组细胞得到粗酶液；

26、或者，所述反应体系中中添加有2-氯苯乙酮，2-氯苯乙酮在反应体系中的终浓度为20-200mm；

27、或者，所述催化反应在缓冲液中反应，所述缓冲液为浓度为50-100mm，ph为7.0-9.0的tris-hcl缓冲液，和/或浓度为50-100mm,ph为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。

28、进一步地，所述诱导表达为向培养体系中加iptg至终浓度0.1-0.6mm,16-28℃诱导培养10-18h；

29、所述能够表达醇脱氢酶或卤醇脱卤酶的核酸分子是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带由所述醇脱氢酶或卤醇脱卤酶的编码基因的细菌质粒、酵母质粒；

30、所述重组质粒具体为将所述醇脱氢酶或卤醇脱卤酶的编码基因替换为pet28a载体的酶切位点nde i和xho i之间的小片段后得到的重组质粒。

31、所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为细菌，所述真核细胞为酵母细胞；

32、或者，在醇脱氢酶催化反应中，还包括辅酶具体为还原型辅酶i即nadh或还原型辅酶ii即nadph；

33、其中，反应体系中nadh的终浓度为50-200mm；

34、反应体系中naocn的反应浓度为底物浓度的1.0-1.5倍。

35、进一步地，所述细菌可为大肠杆菌，优选为e.coli bl21(de3)。

36、本发明取得的优点和积极效果为：

37、1、本发明提供了一种全新的绿色生物合成路线，以2-氯苯乙酮为底物，通过双酶级联催化合成s-4-芳基噁唑烷酮，产物的得率90％以上，ee值大于99％，区域选择性>99:1。本发明操作方便，原子经济性高，产率较高，在生物催化制备s-4-芳基噁唑烷酮具有较好的工业应用前景。

38、2、本发明提供一种醇脱氢酶突变体和卤醇脱卤酶突变体、及其编码基因、含有该编码基因的重组质粒、含有该重组质粒的基因工程菌，及其双酶偶联以2-氯苯乙酮为底物制备手性s-4-芳基噁唑烷酮的应用，旨在解决原始醇脱氢酶活和卤醇脱卤酶区域选择性低的问题，及现有单一卤醇脱卤酶催化合成手性s-4-芳基噁唑烷酮的得率不大于50％的缺点。