一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法与流程

本公开涉及核酸检测，具体涉及一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法。

背景技术：

1、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，lamp）基于链置换dna聚合酶和特殊的引物设计，可在恒温下（通常在60-65℃）进行多轮扩增，短时间内产生大量的目标dna。与常规的pcr相比，lamp具有更高的灵敏度和扩增效率，对于低浓度样本的检测准确度更高；且由于lamp体系中四条引物特异性靶向预扩增dna序列中六段区域，因此扩增过程中不受非靶标dna的影响，具有更高特异性；此外，lamp无需经过模板的热变性、温度循环、电泳等过程，不依赖于精密热循环仪和其他复杂的仪器设备，能极大节约成本和时间，易于在资源匮乏的基层推广应用，且适用于现场快速检测。

2、目前，lamp技术作为一种快速、灵敏且特异性高的核酸扩增方法，已被广泛用于生物医药、环境、水质监测、食品安全等领域。lamp检测中，不需要专门提取dna，直接利用细胞裂解液即可进行扩增、检测，然而，在针对粘性生物样本（例如口腔拭子）的检测过程中，由于有多糖成分的存在，会对lamp扩增过程产生抑制作用，从而降低了lamp检测的灵敏度和检出率。因此，需要开发一种能够提高粘性生物样本中核酸检测效率的方法。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本公开提供如下技术方案：

2、一方面，本公开提供一种检测生物样本中核酸的方法，包括：（1）利用裂解液释放粘性生物样本或多糖样本中的核酸，得到样本裂解液；（2）取样本裂解液进行lamp扩增反应；其中，所述裂解液中包含sr2+。在一些实施方案中，所述生物样本为包含多糖的生物样本。在一些实施方案中，进一步的，所述样本为粘性生物样本。在一些实施方案中，所述样本为口腔拭子生物样本。在一些实施方案中，所述多糖包括硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，所述样本裂解液中目标核酸的浓度选自0.02-2 pg/μl，优选自0.05 pg/μl、0.1 pg/μl、0.2pg/μl、0.3 pg/μl、0.4 pg/μl、0.5 pg/μl、0.6 pg/μl、0.7 pg/μl、0.8 pg/μl、0.9 pg/μl、1.0 pg/μl、1.1 pg/μl、1.2 pg/μl、1.3 pg/μl、1.4 pg/μl、1.5 pg/μl、1.6 pg/μl、1.7 pg/μl、1.8 pg/μl、1.9 pg/μl。

3、在一些实施方案中，所述裂解液中sr2+的浓度可选自0.5-100 mm，优选为0.5-50mm；更优选为0.5-25 mm。在一些实施方案中，所述sr2+的浓度可选自0.5 mm、1 mm、5 mm、10mm、15 mm、20 mm或25 mm。在一些实施方案中，所述裂解液中的sr2+为添加srcl2后产生的。

4、在一些实施方案中，所述裂解液中还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂、螯合剂等。

5、在一些实施方案中，所述缓冲组分为tris，tris的浓度为5-50 mm，优选为10-20mm，更优选为10 mm。

6、在一些实施方案中，所述表面活性剂包括但不限于吐温20、tritonx-100、十二烷基硫酸钠（sds）、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的至少一种。优选为sds，所述sds的质量分数为0.5-10%，优选为1-5%，更优选为1%。

7、在一些实施方案中，所述稳定剂包括非离子表面活性剂和/或氨基酸，其中，非离子表面活性剂可选自peg200、peg2000、peg400、peg4000、peg800、peg8000等；氨基酸可选自甘氨酸、赖氨酸等。在一些实施方案中，所述螯合剂可选自egta、edta·2na、edta·4na、edta、柠檬酸钠、egta、hedta中的至少一种。优选为非离子表面活性剂peg200，所述peg200的质量分数为1-10%，优选为1-5%，更优选为2%。

8、在一些实施方案中，所述螯合剂优选为edta，所述edta的浓度为0.5-10 mm的edta，优选为1-5 mm，更优选为1 mm。

9、在一些实施方案中，所述裂解液的ph值为7.0-9.0；优选的裂解液ph值为7.0。

10、在一些实施方案中，所述裂解液ph值为7.0-9.0，包含5-50 mm的tris、0.5-10 mm的edta、0.5-10 w/v %的sds、1-10 w/v %的peg200，以及0.5-100 mm的sr2+。在一些实施方案中，所述裂解液ph为7.0，包含10 mm的tris、1 mm的edta、1 w/v %的sds、2 w/v %的peg200，以及0.5-100 mm的sr2+。在一些实施方案中，裂解液中sr2+浓度优选为0.5-50 mm；更优选为0.5-25 mm。在一些实施方案中，所述sr2+的浓度可选自0.5 mm、1 mm、5 mm、10 mm、15 mm、20 mm或25 mm。

11、在一些实施方案中，所述lamp扩增反应的扩增体系包含缓冲液、mgso4、dntp、bstdna聚合酶、引物组及荧光指示剂。在一些实施方案中，在扩增体系中，所述mgso4的终浓度为2-10 mm；所述dntp的终浓度为1-2 mm；所述bst dna聚合酶的终浓度为0.16-0.48 u/μl。在一些实施方案中，扩增体系中还包含灭菌无酶水。在一些实施方案中，所述缓冲液中包含tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4及triton x-100。

12、在一些实施方案中，所述荧光指示剂可选自羟基萘酚蓝(hnb)、钙黄绿素、sybrgreen、evagreen、syto等。在一些实施方案中，所述荧光指示剂优选为syto。

13、在一些实施方式中，所述引物组为针对目标核酸序列设计的特异性lamp引物组，包含一对外引物f3/b3、一对内引物fip/bip、可选的还包含环引物loopf和/或loopb。在一些实施方案中，所述扩增体系中f3/b3引物对的浓度为0.1~0.4 μm，所述fip/bip引物对的浓度为0.8~3.2 μm。在一些实施方案中，所述loopf和/或loopb引物对的浓度为0.4~1.6 μm。其中“引物对的浓度”是指引物对中每条引物的浓度。

14、在一些实施方案中，所述lamp反应的扩增体系包含1×缓冲液、8 mm mgso4、1.6 μm fip/bip引物对、0.2 μm f3/b3引物对、0.8 μm loopb引物、1.4 mm dntp、syto染料和0.32 u/μl bst dna聚合酶。在一些实施方案中，所述1×缓冲液的ph为7.0-9.0，包含10-30mm tris-hcl、50-150 mm kcl、5-20 mm (nh4)2so4、1-5 mm mgso4及1-3 w/v % triton x-100。在一些实施方案中，所述1×缓冲液的ph为8.8，包含20 mm tris-hcl、100 mm kcl、10mm (nh4)2so4、2 mm mgso4及1 w/v % triton x-100。

15、本公开所述的粘性生物样本是指源自于生物体中，包含大量的多糖成分的样本。在一些实施方案中，所述粘性生物样本为痰液、宫颈粘液、鼻咽拭子、口腔拭子、生殖器拭子、灌洗液等，优选为口腔拭子生物样本。

16、在一些实施方案中，本公开所述的方法可用于微量核酸成分样本的检测。在一些实施方案中，所述扩增体系中加入的目标核酸浓度为0.004-0.4 pg/μl。在一些实施方案中，所述扩增体系中加入的目标核酸浓度为0.004-0.4 pg/μl。

17、另一方面，本公开还提供一种裂解液，包含sr2+。在一些实施方案中，sr2+的浓度可选自0.5-100 mm；优选为0.5-50 mm；更优选为0.5-25 mm。在一些实施方案中，所述sr2+的浓度可选自0.5 mm、1 mm、5 mm、10 mm、15 mm、20 mm或25 mm。在一些实施方案中，所述裂解液中的sr2+为添加srcl2后产生的。

18、在一些实施方案中，所述裂解液适用于含有多糖成分的生物样本。在一些实施方案中，所述多糖包括硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，所述裂解液适用于粘性生物样本，所述生物样本优选为痰液、宫颈粘液、鼻咽拭子、口腔拭子、生殖器拭子、灌洗液等生物样本，更优选为口腔拭子生物样本。

19、在一些实施方案中，所述裂解液还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂、螯合剂等。

20、在一些实施方案中，所述裂解液ph为7.0-9.0，包含0.5-50 mm的tris、0.5-10 mm的edta、0.5-10 w/v %的sds、1-10 w/v %的peg200以及0.5-100 mm的sr2+。在一些实施方案中，所述裂解液ph为7.0，包含10 mm的tris、1 mm的edta、1 w/v %的sds、2 w/v %的peg200以及0.5-100 mm的sr2+。在一些实施方案中，所述sr2+的浓度优选为0.5-50 mm；更优选为0.5-25 mm。在一些实施方案中，所述sr2+的浓度可选自0.5 mm、1 mm、5 mm、10 mm、15 mm、20mm或25 mm。在一些实施方案中，所述sr2+为添加srcl2后产生的。

21、另一方面，本公开还提供一种检测生物样本中核酸的试剂盒，包含：1）如本公开所述的样本裂解液：和2）lamp扩增体系。在一些实施方案中，所述lamp扩增体系包含一种或多种缓方案中，所述lamp扩增体系包含1×缓冲液（ph为7.0-9.0，包含10-30 mm tris-hcl、50-150 mm kcl、5-20 mm (nh4)2so4、1-5 mm mgso4及1-3 w/v % triton x-100）、8 mmmgso4、1.6 μm fip/bip引物对、0.2 μm f3/b3引物对、0.8 μm loopb引物、1.4 mm dntp、syto染料及0.32 u/μl bst dna聚合酶。本发明的方法、裂解液或扩增组合物用于提高lamp扩增中，粘性生物样本中核酸的检测灵敏度和检出率，实现对低载量核酸样本的检测，提高粘性生物样本中核酸检测效率。

22、有益效果

23、本公开提供了能提高粘性生物样本中核酸检测效率的方法及其应用，通过向裂解液中添加适量的srcl2，减少样本中的多糖组分对扩增反应的抑制，提高lamp扩增中，粘性生物样本中核酸的检测灵敏度和检出率，实现对低载量核酸样本的检测。