一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、1,3-丁二醇(1,3-bdo)是一种重要的c4平台化学品，它是一种无色、透明、粘稠的液体，带有淡淡的水果香气，由于其毒性极小、保湿性强、抗菌性能和水溶性优异，该化合物被广泛用作在化妆品中的溶剂，并且由于其具有良好的生物相容性，也是合成香料、信息素和药物等工业化学品的关键中间体。全球1,3-bdo市场预计将以5.8％的复合年增长率增长，预计到2030年全球1,3-bdo市场将达到2.701亿美元。目前，1,3-bdo传统的生产工艺主要依赖化石原料，采用高浓度的乙醛缩合加氢，但是此工艺同时也会发生多级醛缩反应，从而导致产率下降且伴有污染性的副产物，近年来，随着全球化资源日渐枯竭，寻找可再生替代资源成为当务之急，研究生物法生产1,3-丁二醇的工作受到越来越多的关注。

2、对于自然界中不能天然合成的化学品来说，则需要构建人工合成路径进行合成。在异源宿主中构建相关化学品的代谢路径时，通常，会从众多的同工酶中去优选其中一种比较好的。很少有研究考虑把不同来源的同工酶进行组合来共表达。在生物合成途径的组装中，一个代谢路径上有很多个酶，这些途径酶之间可能存在匹配性，虽然是同工酶，但是不同的同工酶跟上下游之间酶的匹配效果往往不同，因此，并不能确定在代谢路径中引入任意两种以上的同工酶会有好的效果。例如：大肠杆菌具有将3-羟基丁醛(3-hba)还原为1,3-丁二醇(1,3-bdo)的天然醇脱氢酶，由于醇脱氢酶是1,3-bdo合成途径的最后一种酶，因此需要再次过表达高效的醇脱氢酶来提高1,3-bdo的产量，tayyab islam等人分别考察了来源于klebsiella pneumoniae的dhat、lactobacillus reuteri的pduq、clostridiumacetobutylicum的bdh和e.coli的yqhd四种醇脱氢酶，结果显示只有bdh和yqhd相比对照1,3-bdo的产量有提高，而dhat和pduq却没有改善效果[参考文献：islam t,nguyen-vo t p,gaur v k,et al.metabolic engineering of escherichia coli for biologicalproduction of 1,3-butanediol[j].bioresource technology,2023,376:128911.]，这将以上结论得到了验证。本发明以1,3-丁二醇的合成为例，引入了不同来源的同工酶并确定最佳组合，来验证是否可以通过构建共表达同工酶重组菌株来提高目标产品的产量。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌，所述重组菌同时表达了bld、ald和adhe2中任意2个或2个以上的酶；所述的bld为来源于糖霜梭菌clostridium saccharoperbutylacetonicum的bld基因编码的醛脱氢酶；所述的ald为来源于拜氏梭菌clostridium beijerinckii的ald基因编码的醛脱氢酶同工酶；所述的adhe2为来源于丙酮丁醇梭菌clostridium acetobutylicum的adhe2基因编码的醛醇脱氢酶同工酶(双功能酶)。通过再次过表达代谢路径上所需酶的同工酶，来提高细胞内乙酰辅酶a流向1,3-丁二醇合成途径的代谢通量。

4、优选地，所述的重组菌同时表达了bld和adhe2，或者，同时表达了bld和ald。

5、其中，所述的重组菌还表达了thl、atob和phaa中的任意一个或多个组合的酶；所述的thl为来源于丙酮丁醇梭菌clostridium acetobutylicum的thl基因编码的硫解酶；所述的atob为来源于大肠杆菌escherichia coli的atob基因编码的硫解酶同工酶；所述的phaa为来源于钩虫贪铜菌cupriavidus necator的phaa基因编码的硫解酶同工酶。

6、其中，所述的重组菌还表达了phab，所述的phab为来源于钩虫贪铜菌的phab基因编码的乙酰乙酰辅酶a脱氢酶。

7、其中，优选地，所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab，或者，同时表达了bld、ald、thl和phab，更优选地是所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab。

8、其中，所述的thl，phab，bld，phaa，atob，ald和adhe2基因的核苷酸序列分别顺序对应于seq id no.1-7所示的核苷酸序列。

9、其中，所述的重组菌，其出发菌株为埃希氏菌属(escherichia)，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。

10、本发明的第二方面在于，还提供了一种第一方面所述的重组菌的构建方法，即扩增bld、adhe2和ald中任意2个或2个以上的基因，构建重组载体，导入出发菌株，得到重组菌。

11、其中，所述构建方法具体包括如下步骤：

12、(1)扩增thl、phab和bld基因，并以rbs连接，将三个基因克隆至第一质粒载体中，得到第一重组载体；

13、(2)将第一重组载体导入出发菌株，得到第一重组菌株；

14、(3)分别扩增ald和/或adhe2基因，同时分别扩增phaa和/或atob，将扩增的基因克隆至第二质粒载体中，得到第二重组载体；

15、(4)将第二重组载体导入第一重组菌株，即得。

16、其中，所述的第一质粒载体为pacycduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1或pcoladuet-1中的任意一个；所述的第二质粒载体为能与第一质粒载体共存的质粒，优选pet28a、pet23a、pet30a或pet29a中的任意一种。

17、优选的构建方法如下，(1)扩增thl、phab和bld基因，以扩增下来的thl基因和phab基因为模板，进行overlap，两个基因之间以rbs连接，将扩增下来的thl+phab克隆到pcdfduet-1载体的sal i和not i酶切位点间，得到中间重组载体pcdfduet-1(thl+phab)；以pcdfduet-1(thl+phab)为基础，将扩增下来的bld基因克隆到nde i和xho i酶切位点间，得到第一重组载体pcdfduet-1(thl+phab-bld)。

18、(2)将第一重组载体导入出发菌株大肠杆菌bl21(de3)中，得到第一重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcdfduet-1(thl+phab-bld)。

19、(3)分别扩增ald和/或adhe2基因，同时分别扩增phaa和/或atob，将扩增的基因克隆至第二质粒载体pet-28a中，得到第二重组载体pet-28a(phaa)、pet-28a(atob)、pet-28a(ald)、pet-28a(adhe2)。

20、(4)将步骤(3)所述的第二重组载体分别导入第一重组菌株的感受态中，分别得到重组菌株如下所述：

21、第二重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcdfduet-1(thl+phab-bld)+pet-28a(phaa)；

22、第三重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcdfduet-1(thl+phab-bld)+pet-28a(atob)；

23、第四重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcdfduet-1(thl+phab-bld)+pet-28a(ald)；

24、第五重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcdfduet-1(thl+phab-bld)+pet-28a(adhe2)。

25、本发明的第三方面在于，提供一种第一方面所述的重组菌在发酵生产1,3-丁二醇中的应用。

26、其中，将所述的重组菌接种至发酵培养基，20～35℃发酵培养72～144h。优选地，将所述的重组菌种子液接种至发酵培养基，所述的重组菌种子液的制备方法为：将重组菌接种于含有抗生素的培养基(优选为lb培养基)中于37℃，200rpm培养8-12h，即得。

27、其中，所述的发酵培养基包括碳源5～30g/l，氮源10～15g/l，无机盐8～15g/l和碳酸钙10～40g/l；优选地，所述的碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖或甘油中的任意一种，所述的氮源为蛋白胨、酵母粉、肉浸液或牛肉浸膏中的任意一种或两种的组合，所述的无机盐为nacl、kcl、mgcl2或mgso4中的任意一种。更优选地，所述的发酵培养基包括蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖5～30g/l和碳酸钙10～40g/l。最优选地，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖30g/l和碳酸钙20g/l。其中，碳酸钙用于调节发酵过程中的ph值，在重组菌发酵产1,3-bdo的过程中，会积累高浓度的乙酸，乙酸是大肠杆菌生长的主要抑制物质，而且也是抑制目标产物生产效率的主要物质。

28、其中，所述的发酵培养基还包括效应物，所述的效应物为半胱氨酸、谷氨酸、柠檬酸和天冬氨酸中的任意一种或多种的组合；优选地，所述的半胱氨酸添加浓度为0.2～5g/l；所述的谷氨酸添加浓度为0.2～5g/l；所述的柠檬酸添加浓度为0.2～3g/l；所述的天冬氨酸添加浓度为0.2～5g/l；更优选地，所述的效应物为柠檬酸，添加浓度为0.8g/l。通过外源添加柠檬酸，能够在一定程度上抑制tca循环，从而能够增加流向1,3-bdo的碳通量，另外，当胞内atp充足时，柠檬酸也能够穿梭进入胞浆转变为乙酰辅酶a，从而增加1,3-bdo的底物合成。

29、其中，所述的重组菌接种量为1％～5％v/v；优选为2％v/v。

30、优选地，所述的发酵培养，装液量为10％～30％v/v，转速为100～300rpm。更优选装液量为20％v/v，转速为250rpm。

31、其中，当发酵至od600为0.6～0.8时加入终浓度为0.01～1mm的iptg进行诱导，并在培养18～24h和45～50h时补充终浓度为20～40g/l的碳源。优选地，发酵至od600达到0.6～0.8时加入终浓度为0.01mm的iptg进行诱导，诱导后30℃，250rpm培养72h，并在培养24h和48h时补充终浓度为30g/l的碳源。

32、有益效果：与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

33、(1)本发明通过将thl、phab和bld导入宿主细胞中，构建了1,3-bdo的基础合成路径，后又过表达了乙酰辅酶a到乙酰乙酰辅酶a的酶(相关基因为phaa和atob)和3-羟基丁酰辅酶a到3-羟基丁醛的酶(相关基因为ald和adhe2)，从而构建成了产1,3-bdo的同工酶共表达重组菌株，为增加目标产品产量提供了一种新的思路。

34、(2)本发明同时对发酵体系进行优化，提供了一种同工酶共表达重组菌生产1,3-bdo简化的ph调节方案，并且通过添加不同的效应物，优化所添加效应物的浓度，提高了1,3-bdo的产量，最终重组大肠杆菌发酵可生产16.18g/l的1,3-bdo，转化率为0.36mol/mol。