一种针对人合胞病毒的新型的RSVBmRNA疫苗的制作方法

本发明涉及生物医药。具体涉及到一种针对人合胞病毒的新型的rsv bmrna疫苗的设计及应用，属于免疫药物。

背景技术：

1、基于核酸等生物大分子的细胞内递送技术，近年来得到了创新药研发领域的广泛关注,其中，基于mrna技术的新型疫苗在紧急需求之下，研发、临床试验及上市批准被迅速推进，向世界第一次展现了mrna技术平台的临床有效性，安全性和商业价值。与传统的直接以蛋白质或多肽作为药物活性成分的药物相比，mrna技术有诸多优势：

2、1)更高的生物活性与安全性：mrna技术的药物，其蛋白表达、相关结构的糖基化、末端修饰、去甲基化等复杂的蛋白修饰过程皆于人体自身细胞内且按照天然路径完成。无论是从合成原料的分子结构还是合成环境上考虑，都与人体高度同源。因此，相比于传统蛋白质制剂体外细菌体系或细胞体系，基于mrna序列的内源性蛋白质产物具有更准确的作用特异性，更高的亲和力和与之伴随的更值得期待的生物活性。

3、2)更长的生物半衰期：现有实验结果证实，包括抗体在内，通过mrna来生成的蛋白质，尤其是采用自复制核酸或环状核酸，可以维持较长时间的有效血液浓度，从而降低用药频率和用药量，降低药物副作用，提高患者顺应性。

4、3)更多的应用场景:通过基于递送技术的剂型和多样化的给药方式的开发，mrna制剂可以接触到多种临床作用靶点，提高药物活性成分的局部区域浓度和药效，在丰富了新药开发的范围的同时，也丰富临床上患者治疗方式的选择。

5、4)更低的生产成本：相较于蛋白质，mrna工业化生产中最显著的优势在于流程短，较少的中间产物和较短的生产周期，更容易纯化和质控，表现出更高的生产效率。

6、5)快速响应：mrna疫苗在产品开发流程中应用到的技术多为基本的分子生物学方法，技术转移相对容易。一个成熟的mrna平台，从针对不同病原体的基因测序、设计至生产，只需要数周的时间，在对于时间要求比较紧急的疫情中能迅速应对，及时发挥疫苗的重要作用。

7、人类呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hrsv)是副粘病毒科肺病毒属的一种有包膜的不分节段负链rna病毒，是一种长期全球高度流行的，传染性很强的呼吸道病毒。其传染性和致病性仅次于流感，导致婴儿患细支气管炎、成人患普通感冒，以及老年人和免疫功能低下者患上更严重的呼吸道疾病，例如肺炎。每年在世界范围内影响超过6400万人。由于2023年以前没有预防性疫苗或有效的抗病毒药物，rsv感染带来巨大的健康隐患和经济负担。每年因rsv感染造成全球超过300万人住院，近6万人死亡，其中近一半发生在6个月以内的婴儿。仅在美国，老年人的rsv感染每年导致17.7万人住院，1.4万人死亡，住院费用超过10亿美元。

8、rsv基因组总长约为15,000个核苷酸，由10个基因组成，编码11种蛋白质，其中表面的融合蛋白(fusion protein,f)和糖蛋白(glycoprotein,g)最引人注意。根据f和g表面蛋白对单克隆抗体的反应性，rsv分为两种抗原亚型：a和b，这些亚型往往在当地流行病中同时传播。

9、f蛋白序列在菌株之间高度保守，并以多种构象形式存在。在融合前状态(pre-f)，蛋白质以三聚体形式存在，并包含主要抗原位点在与宿主细胞表面的靶标结合后，pre-f会发生构象变化，会丢失，最终的构象转变导致蛋白质的形式更加稳定(融合后，post-f)。rsv病毒颗粒的内部是核蛋白(n)、磷酸化丙酯(p)和大聚合酶蛋白(l)结合病毒rna组成，它被基质蛋白(m)包围，并被包裹在脂质双层中，融合蛋白(f),附着蛋白(g)和小疏水蛋白(sh)。其中，由于f基因的跨株型保守性，蛋白稳定性，和较少的糖基修饰性，f蛋白在rsv进入宿主细胞过程中发挥着重要作用，最终成为疫苗的热门抗原。

10、自然界中，rsv f蛋白最初表达为单一多肽前体f0，在弗林蛋白酶样蛋白酶切下，产生f1、f2和pep27多肽。其中f1和f2通过两个二硫键连接，形成成熟的f蛋白，并以三聚体的结构锚定在病毒膜中。感染前，f三体是以亚稳态的预融合构象存在的，而这一形态正是f蛋白特异性抗体识别和结合f蛋白的状态。当病毒通过f蛋白接触到有受体的靶细胞，该构象被触发，发生变化，将病毒膜和细胞膜拉近并融合，这时候的f蛋白构象，被称作融合后f。由于rsv f蛋白在rsv进入细胞过程中发挥着重要作用，因此它是中和抗体的目标，也是疫苗开发的主体。然而，与其他rsv抗原一样，先前基于rsv f蛋白的疫苗开发努力已被证明并不成功。

11、自1957年rsv首次在人群中被发现，对rsv疫苗的尝试几十年来从未间断过。然而，由于技术的滞后，从灭活疫苗造成更为严重的感染，到后来的蛋白疫苗，病毒载体疫苗，研究者一直在效价，g蛋白，f蛋白，还是n蛋白作为抗原，主要是诱导t细胞的细胞免疫还是b细胞的体液免疫，等诸多问题上纠结，积累了大量的经验，但始终没有获得成功的rsv疫苗，直至2023年,美国食品和药物管理局(fda)批准了最初二款rsv蛋白疫苗(gsk和pfizer)。

12、近半个世纪以来，rsv疫苗的研发一直是呼吸道疫苗领域的热点，从灭活疫苗，到蛋白疫苗，重组疫苗，尝试了许多不同的方法，但在临床试验阶段屡屡受挫，达不到所需的保护率。近年来，随着结构分子生物学的介入，人们对疫苗的工作原理有了突破性的认识。我们的设计，正是结合了最新的抗原蛋白结构生物学发现和对病毒流行病学和毒株的深入的了解，设计和合成了我们独有的rsv mrna/lnp疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中rsv疫苗不足，安全性较低的问题，提供一种新的、高效的、高安全性的rsv b mrna疫苗。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明公开了一种重组人合胞病毒mrna，所述mrna的编码序列选自如seq id no:1-15所示的序列。

4、优选的，所述mrna的编码序列如seq id no:2-6，13-15所示。#009系列，包括jy-b-009-ggg，jy-b-009-agg，jy-b-009-120，jy-b-009-better，jy-b-009-better plasmid，以及jy-b-021，jy-b-022，jy-b-023。

5、本发明公开了表达载体，所述表达载体表达所述的mrna分子。

6、本发明公开了细胞，所述细胞包含所述的表达载体。

7、本发明公开了重组蛋白，所述重组蛋白由所述的mrna翻译获得。

8、本发明公开了重组蛋白，所述重组蛋白由所述的mrna在体内翻译获得。

9、本发明公开了重组核苷酸，所述重组核苷酸编码所述的重组蛋白。

10、本发明公开了质粒，所述质粒包含所述的重组核苷酸。

11、本发明公开了mrna/lnp复合物，包括所述的mrna分子和脂质纳米颗粒。

12、本发明公开了mrna/lnp复合物的制备方法，包括如下步骤：

13、1)将所述的mrna溶解在醋酸盐缓冲液中；

14、2)将可电离阳离子、dspc、胆固醇、peg-2000按比例配置成混合溶液；

15、3)将步骤2)中的混合溶液与步骤1)中的含有mrna的缓冲液在微流控设备中混和，并进行稀释和提升ph值，获得mrna/lnp复合物。

16、优选的，所述醋酸盐缓冲液的ph值为4.5。

17、优选的，所述可电离阳离子为sm-102。

18、本发明公开了mrna/lnp复合物，所述复合物按照所述的方法制备得到。

19、本发明公开了疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述的质粒和/或所述的表达载体和/或所述的合成的mrna和/或合成的蛋白和/或所述的mrna/lnp复合物。

20、优选的，还包括佐剂。

21、所述的mrna和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的重组核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mrna/lnp复合物在制备人合胞病毒疫苗组合物中的应用。

22、本发明通过对合胞病毒株的筛选以及病毒f蛋白编码序列和前后协助蛋白表达序列的优化，获得了多个合胞病毒的mrna疫苗设计序列。将获得的序列质粒合成后，在体外转录后成功制备获得mrna/lnp复合物。将rsv mrna/lnp纳米颗粒转染至293t细胞，成功检测到高表达的重组蛋白，将复合物免疫小鼠，可在小鼠体内诱导出的病毒特异性抗体，并且诱导的抗体具有中和病毒，阻止病毒感染的能力。

23、rsv f mrna/lnp纳米颗粒免疫后再对小鼠和棉鼠进行rsv感染，测试肺部感染rsv的情况，可以明显抑制小鼠和棉鼠肺部病毒的数量，恢复小鼠和棉鼠的体重，能够对肺部感染的小鼠和棉鼠起到保护作用。尤其对于棉鼠，疫苗组肺脏炎性浸润综合评分呈现显著降低趋势。

24、本发明的mrna/lnp纳米颗粒疫苗，对已经感染过rsv病毒的动物进行加强疫苗注射，极大地提高了抗体含量，预示着具有非常好的病毒保护效果。在人群中给予加强免疫，可以极大的控制rsv病毒感染。