一种人HPV分型检测用引物以及crRNA、试剂盒与分型检测方法与流程

本发明属于生物技术，为一种人hpv分型检测用引物以及crrna、试剂盒与分型检测方法，具体涉及一种多重rpa结合crispr/cas12a的poct技术在人hpv分型检测中的应用。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒（hpv）是一种无包膜的环状双链dna病毒，99.7%的子宫颈癌都可检出高危型hpv，其低危型别则主要引起生殖器疣或其他良性病变。世界卫生组织于2020年发布的关于子宫颈癌防治倡议中强调70%的女性在35和45岁之前应各接受一次高效的宫颈癌筛查；于2021年发布的最新版《预防宫颈癌：宫颈癌前病变筛查和治疗指南》中推荐将hpvdna检测作为筛查的首选方法。

2、目前已明确的hpv型别繁多，但其中仅十余种高危型hpv与子宫颈、乳腺等妇科相关肿瘤的发生发展密切相关，高效、灵敏的分型检测手段对做好hpv风险分层管理有极为重要的意义。现阶段hpv筛查手段以聚合酶链式反应（pcr）及其衍生技术为主，临床诊断也将qpcr检测结果作为主要依据，但这些方法均为实验室技术，需要依托实验室仪器设备及专业检测人员；同时其检测周期长，检测场景要求严格等特点使得这些技术在医疗资源匮乏的地区很难大规模展开，导致目前世界范围内许多地区hpv筛查的普及率较低。因此，建立一种不依赖实验室设备和专业检测人员的现场快速检测（point of care testing，poct）甚至可实现家庭自检的hpv poc检测技术及产品，可有效提升hpv筛查的普及率，满足基层医疗市场及家庭自检hpv筛查的需求，具有巨大的市场潜力。

3、目前，成熟的hpv poct商品化产品如hpv检测试纸等采用的是细胞学染色相关原理，灵敏度和特异性远低于分子检测手段；抗体抗原相关检测手段则有检测窗口期，并易造成假阳或假阴性误检；其它在研的仅基于恒温扩增技术如lamp、rca、raa等的hpv核酸poc检测手段则有着检测通量低、特异性无法保证、缺乏精确分型手段等的技术瓶颈，难以实现灵敏的多重分型检测。新一代基于分子原理的hpv poc检测技术研发迫在眉睫。

技术实现思路

1、许多文献尝试建立恒温扩增结合crispr技术的hpv poc检测手段，但由于多重扩增常见问题的限制，对于hpv检测，大多只针对16、18两种主要高危型别而难以覆盖多种高/低危型别；覆盖型别广泛的则灵敏度、特异性有欠缺或相关验证实验不够全面。本发明采用rpa结合crispr/cas12a的技术，针对hpv16、18、31、33、35、45型这六种主要高危型hpv，有效解决了rpa多重扩增易出现引物间相互作用导致的扩增通量低的技术难题，建立了在一个反应管内实现六重rpa的扩增体系；通过六条crrna实现对这六种高危型hpv的分型检测，实现了37℃、40min反应时间内检测深度均可达1 copy/μl。该检测体系可借助微流控芯片对多个反应步骤及试剂进行集成整合，实现该六种高危型hpv的poc检测。此外，在临床样本验证阶段，采用qpcr方法对照验证34例临床样本，结果显示构建的h-mrc12a（hpv-multiplerpa-crispr/cas12a）检测系统与qpcr方法检测结果高度一致。因此，本发明很大程度上推动了hpv高危型分型检测的poc化发展，促进了hpv检测的普及率的提高，并助力了hpv患者的风险分层管理走向规范化、精准化与普及化。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种rpa结合crispr/cas12a的人hpv分型检测方法，包括以下步骤，对样本进行rpa反应，然后以rpa产物为模板进行crispr反应，再进行荧光判读，完成人hpv分型检测。

4、本发明中，rpa反应时，正向引物包括seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8中的一种或几种；反向引物包括seq id no.9、seq id no.13、seq id no.14中的一种或几种。

5、进一步的，rpa反应时，反应体系包括rpa buffer、功能酶、mgoac、dna template、无核酸酶水；具体都为常规产品。优选的，rpa反应的条件为，37℃反应10～30min；进一步优选的，第3～5min时震荡。

6、本发明中，crispr反应时，crrna包括seq id no.15～seq id no.20中的一种或几种。

7、进一步的，crispr反应时，crispr体系还包含lba cas12a、ssdna reporter、nebbuffer、无核酸酶水；具体都为常规产品。优选的，crispr反应的条件为，37℃反应10～30min。

8、本发明rpa结合crispr/cas12a的人hpv分型检测方法可以进行单重反应，也可以进行多重反应。

9、本发明公开了上述rpa结合crispr/cas12a的人hpv分型检测方法用引物以及crrna，其中正向引物包括seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq idno.8中的一种或几种；反向引物包括seq id no.9、seq id no.13、seq id no.14中的一种或几种；crrna包括seq id no.21中的一种或几种。

10、本发明还公开了上述rpa结合crispr/cas12a的人hpv分型检测方法用试剂盒，包括引物、crrna以及反应试剂，其中正向引物包括seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8中的一种或几种；反向引物包括seq id no.9、seq id no.13、seq id no.14中的一种或几种；crrna包括seq id no.15～seq id no.20中的一种或几种。

11、进一步的，反应试剂中的ssdna reporter为seq id no.21。

12、进一步的，上述rpa结合crispr/cas12a的人hpv分型检测方法用试剂盒还包括甜菜碱。

13、本发明中，样本为dna样本，具体获取方法为常规技术，可以从组织样常规提取。荧光判读也为常规技术。都不影响本领域技术人员对本发明技术效果的理解。

14、虽然位于l1区域的通用pcr引物（my011等）能够对多型别hpv进行有效扩增，但一方面这些通用引物能够扩增的hpv型别无规律，且有些扩增区域过于保守，不易进行分型研究；另一方面pcr引物改造为rpa引物会面临许多问题：近2倍pcr引物长度的rpa引物对通用引物两端延伸方向的序列保守性提出较高要求；且由于crispr/ cas12a系统对扩增子包含的cas12a pam位点亦有严格要求。为了从根本上解决多重扩增引物间序列差异导致的多聚体问题，本发明自行进行扩增子区域与引物池构建。hpv各型别扩增子片段在全基因组同一位置且包含多个pam位点，在这些pam位点中，部分位点3’端方向延伸的20余碱基保守性高，其余位点的3’端方向延伸的20个碱基则序列差异较大，这为分型检测的特异性crrna设计提供了基础，同时也能够为不分型检测提供可能，这种严苛的要求也使得rpa引物的设计非显而易见。目前poct领域中针对hpv的研究大多都仅局限于16/18型，研究者们拓展检测型别则很难兼顾多重检测体系的稳定性与灵敏度，远不能满足临床hpv的检测需求。rpa技术可以很好的平衡信号放大与体系稳定性需求，但多重检测中的引物相互影响导致灵敏度下降这一问题一直是此类扩增技术的突破难点。现有技术参考多条通用pcr引物构建了引物池与crrna池，能够检测多种hr- hpv，但该研究并未从根本上解决多重扩增的引物问题，其引物数量过多且序列差异大会导致灵敏度、稳定性的大幅降低，且未能对两个体系进行整合。本发明用新的思路尝试解决多重rpa的引物问题以改善多重检测的灵敏度，通过crispr/cas12a系统及crrna的设计，构建h-mrc12a法，实现了六种hr-hpv的高特异性分型检测。很好的遏制了多重引物间的二聚体现象，同时，可有效提升多重rpa的灵敏度。本发明通过引入betaine来稳定bsu聚合酶与模板dna链的结合，帮助其通过dna链上的复杂碱基，提升rpa同源识别环节的特异性与链交换反应的稳定性，并提高uvs x-ssdna的结合稳定性从而促进同源识别进程，进一步提升了前置rpa反应稳定性与灵敏度，甚至将hpv 45型的检测拷贝数提升了一个数量级。

15、crispr系统的多种cas蛋白在检测领域均有应用，但其作为兼顾生物传感和信号放大功能的复合系统，其在两个方面的延伸都较为有限；当其应用在poct领域时，生物传感方面就需要搭配合适的后置生物传感手段如荧光探针、电化学、光谱等相关技术等实现分子信号转换进而完成poct的结果呈现。为了进一步提升检测深度，crispr系统则需搭配如lamp、rpa、sers等能实现信号放大的技术作为前置手段。但无论哪种技术搭配，想真正实现poct分型检测都需要一种能够整合各方技术的媒介进行一体化的集成整合，以微流控芯片技术为整合媒介是众多选择中的一种，以lfb横向流动试纸或微流控双液滴装置等为载体也是多种探寻方向之一。近年来人乳头瘤病毒的poct相关研究大多聚焦在crispr系统及其后置生物传感环节的创新上，但现有研究均仅针对hpv 16/18型或仅以hpv作为验证模板，检测范围远无法满足需求。hpv型别众多，实现hr-hpv poct分型检测是hpv风险分层管理的重要前提。本发明选择了能在37℃发挥活性并可直接识别dna靶序列的cas12a作为核心功能蛋白，通过设计特异性的crrna，对6种hr-hpv进行分型检测，尤其是，本发明在grna末端加入特殊设计的发卡序列来防止crrna与靶标序列结合后可能的脱靶现象，并提升其碱基分辨能力。发卡结构通过形成高度扭曲的构象紧密结合在cas蛋白的核酸结合结构域，稳定cas蛋白构象并提高crispr系统特异性。研究表明crrna中发卡结构的引入将crispr系统的碱基分辨能力提升至少3倍，且发卡结构序列的变化也会影响crrna的碱基识别能力。crispr反应系统中grna与靶点配对后会激活cas12a的核酸酶域，使cas蛋白对体系内的famssdna探针进行无差别切割并反馈荧光信号，在300nm波长紫外光照射，可实现肉眼对各型hpv进行有效分型检测结果的判定。此外，本发明发现单个体系中crrna的种类过多会严重影响体系稳定性，出现严重的假阳性结果，本发明进行crrna设计以大幅度精简crrna池，从而构建高度稳定的不分型检测方法。

16、总体来说，本发明成功构建了针对多型hr-hpv的高灵敏多重rpa扩增体系，结合crispr/cas12a系统，能在37℃条件下40min内完成六种hr-hpv的分型检测并肉眼现场判读，且对各型别检测深度均达1 copy/μl。且本方法开发潜力巨大，可依据给出的思路继续提高检测通量或灵活转换为不分型检测。因此，本发明推动了hpv高危型分型检测的poc化发展，促进了hpv检测的普及率，同时，h-mrc12a联合检测系统构建过程中的许多构想能够为其他病原体的poct化研究提供新的启迪与思路。