用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的直接扩增试剂、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物，具体涉及用于核酸质谱检测的直接扩增试剂、试剂盒及方法。

背景技术：

1、诸多研究表明，特定人群携带有某种与疾病相关的易感基因。当这些人群暴露于不利环境或不良因子时，其患相应疾病的概率相较于不携带易感基因的人群显著增加，可达数十至数千倍之多。随着社会经济的发展、国民生活方式的改变以及老龄化时代的到来，心脑血管疾病负担日趋沉重，严重威胁着人类的健康，主要包括高血压、心绞痛、心律失常、心力衰竭、心肌梗死等。因此，为有效预防心血管疾病，应进行相关易感基因的筛查，以便尽早发现潜在风险。

2、鉴于心脑血管易感基因检测涉及众多位点，荧光定量pcr法在实际应用中往往仅能覆盖3-5个位点，因而难以满足大规模位点的检测需求。虽然高通量测序技术具备多基因多位点检测的能力，但其成本较高、操作复杂且耗时较长。核酸质谱检测技术，可实现多种疾病多位点的准确检测，同时具备高准确性、强灵活性、高通量、检测周期短以及性价比优势，因此适用于心脑血管易感基因的检测。核酸质谱检测是将通过直接多重pcr反应(直接扩增)、sap反应及单碱基延伸反应得到目标位点特异性的延伸产物片段经过脱盐后，自动点样在芯片基质上，形成共结晶，制得的共结晶在质谱仪的真空管内经强激光激发，核酸分子解吸附为离子，带正电的单电荷离子在真空管中加速向高度灵敏的检测器飞去；电场中离子飞行时间与离子质量成正比，离子质量越小就越快到达检测器。因此可通过飞行时间差异，把不同质量的离子区分开。

3、然而，基于pcr技术的检验方法与检测手段在扩增前，需对生物样本的dna进行提取与纯化。然而，常规dna提取方法如有机法、硅珠法、chelex法等存在操作步骤繁琐、耗时长、提取效率较低、使用有毒有害有机试剂等技术缺陷。为了突破样本高通量检测的局限，提升样本检验效能，研究人员致力于省略dna提取环节，直接针对适量生物样本实施pcr扩增操作，此即所谓的直接扩增技术(direct pcr)。

4、直接扩增技术又称直接pcr或免提取扩增技术，是一种无需提取样本直接加入pcr反应体系扩增产物的操作，与传统方法相比，直接扩增技术省略了样本提取步骤，节省成本及时间，并且也避免提取过程中造成的样本污染等问题。直接扩增技术中比较常见的样本类型有血液、唾液以及血卡载体(如fta卡、903卡及滤纸等)。其中，血卡是针对各种不同类型样本较好的收集、长期保存、运输的载体，一般可以常温保存5～10年，同时血卡纯化后的核酸样本可以用于后续的pcr、rt-pcr、酶切等分子操作。直接扩增目前常用于法医str检测，尚未与核酸质谱检测技术进行结合。

5、发明人团队尝试将直接扩增技术与核酸质谱检测相结合，以期进一步降低检测成本及检测时间，提高检测通量。然而，实验过程中发现，对血卡样本进行直接扩增时，由于血卡样本中含有大量的pcr抑制剂，往往会导致扩增效率降低或扩增失败。另一方面，现有技术中的直接扩增试剂(如中国专利cn 103305499 a、cn 112481360 a)一般是针对str荧光复合扩增进行设计的，此类试剂成分复杂，会严重影响样品延伸产物片段与核酸质谱芯片基质的共结晶状态，导致基质被带走或检测峰质量偏低，坏点率增加。因此，亟需探寻一种可用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，该试剂既要耐受血液、血卡样本，实现对血液、血卡样本的多重扩增效果，保证扩增的效率，又要防止直接扩增试剂中的添加剂不影响核酸质谱上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中直接扩增试剂无法耐受血液、血卡样本，且成分复杂导致样品延伸产物片段与芯片基质的共结晶效果差、坏点率高的问题，本发明提供了一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，以及含有该直接扩增试剂的用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒及方法。该直接扩增试剂不仅可兼容血液和血卡样本，实现对这两种样本的多重扩增效果，确保扩增效率，且成分简单，不会对上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果产生负面影响。本发明还将该直接扩增试剂应用于制备用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，仅需1ul全血样本或0.5mm血卡样本，单孔一次检测即可实现16个snp位点的同时检测，有效提高了检测效率及准确率，降低检测成本。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，包括非离子表面活性剂、醇类化合物、bsa、tris-hcl缓冲液。

3、作为优选，所述非离子表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80、tritonx-100中的至少一种，更优选为吐温20；所述醇类化合物为peg400、peg600、peg6000、peg8000、丙三醇中的至少一种，更优选为peg6000。发明人团队通过对不同成分交叉试验，并在直接扩增试剂中添加合适浓度的bsa、tris-hcl缓冲液等，筛选出较佳的添加剂，即所述的非离子表面活性剂及醇类化合物，配置得到的直接扩增试剂可以实现对血液样本、血卡样本的直接扩增，并具有很好的灵敏度、特异性，且不会对上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果产生负面影响。

4、作为优选，所述非离子表面活性剂的终浓度为1％-1.5％(如1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％)，更优选为1％-1.2％。

5、作为优选，所述醇类化合物的终浓度为5％-5.5％(如5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％或5.5％)，更优选为5％-5.3％。

6、作为优选，所述bsa的终浓度为800～1000μg/ml(如800μg/ml、900μg/ml或1000μg/ml)，更优选为1000μg/ml。

7、作为优选，所述tris-hcl缓冲液的终浓度为1～1.2mmol/l(如1mmol/l、1.1mmol/l或1.2mmol/l)，更优选为1.2mmol/l。

8、本发明对直接扩增试剂中的各成分设计了不同的浓度梯度，配制成不同的直接扩增试剂，用于对样品进行直接扩增，经sap反应、延伸反应后使用核酸质谱仪自动点样模块将使用不同直接扩增试剂配方的样品点在芯片的基质点上，使样本与基质共结晶，查看基质点样前后的形态，最终确定了较优的直接扩增试剂，所述的直接扩增试剂由终浓度为1％-1.2％吐温20、1000μg/ml bsa、5％-5.5％peg6000、1.2mmol/ltris-hcl组成。

9、本发明还提供了所述的用于核酸质谱检测的直接扩增试剂的应用，为下列(1)-(4)中的至少一种：

10、(1)对样本进行dna分型检测；

11、(2)对样本进行直接扩增；

12、(3)制备用于对样本进行dna分型检测的试剂盒；

13、(4)制备用于对样本进行直接扩增的试剂盒。

14、本发明还提供了一种用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，包括所述的用于核酸质谱检测的直接扩增试剂、扩增引物、延伸引物。作为优选，所述扩增引物选自碱基序列如seq id no.1-32所示序列中的至少一种，所述延伸引物选自碱基序列如seq id no.33-48所示序列中的至少一种。可以理解的是，所述的试剂盒不局限于表2所示的16种心脑血管疾病易感基因的检测，所述试剂盒中针对某一检测位点的扩增引物、延伸引物可单独应用于对应位点的检测，可根据需求选择其中任意位点的扩增引物、延伸引物进行实验、结果分析、出具报告；也可通过对现有扩增引物、延伸引物设计方法进行改进使得同一个试剂盒还适用于单碱基缺失、短片段插入或缺失等其他突变类型的检测。同样可以理解的是，所述试剂盒可包括一个或多个用于不同位点检测的扩增引物/延伸引物组合物，用于一个位点的检测或多个位点的联合检测。

15、表2.用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的引物组

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18、本发明基于基质辅助激光解吸-电离飞行时间(maldi-tofms)质谱技术，针对人心脑血管易感基因16个位点区域(表2)设计pcr扩增引物及单碱基延伸引物，通过直接扩增反应、sap反应及单碱基延伸反应得到目标位点特异性的延伸产物片段，单碱基延伸产物转板上机，经过树脂脱盐，自动点样在芯片基质上，形成共结晶。共结晶在质谱仪的真空管内经强激光激发，核酸分子解吸附为离子，带正电的单电荷离子在真空管中加速向高度灵敏的检测器飞去。电场中离子飞行时间与离子质量成正比，离子质量越小就越快到达检测器。因此可通过飞行时间差异，把不同质量的离子区分开。如表1所示，本发明根据易感基因相应位点上下游200bp的基因序列设计了上下游扩增引物，所述的扩增引物可保证扩增产物在50-200bp之间，并根据分子量设计所述的延伸引物。在设计相应的延伸引物时，需保证16个位点的延伸引物峰及延伸峰都有不同的分子量，并且峰之间分子量差别不低于16da，使质谱结果中每一个峰都对应不同的dna分子，即可以实现核酸质谱平台对人心脑血管易感基因16个位点的单孔同时检测。

19、表2.人心脑血管易感基因检测位点

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22、在本发明一个或多个实施例中，多种碱基序列如seq id no.1-32所示的扩增引物构成扩增引物混合物，所述扩增引物混合物中每种扩增引物的终浓度优选为0.2μm。

23、在本发明一个或多个实施例中，多种碱基序列如seq id no.33-48所示的延伸引物构成延伸引物混合物，所述延伸引物混合物中每种延伸引物的终浓度优选如表3所示。

24、表3.延伸引物混合物

25、 基因 检测位点 延伸引物 终浓度(μm) thbd rs16984852 seq id no.33 5.73 proc rs199469469 seq id no.34 5.83 apoe rs429358 seq id no.35 6.05 nynrin rs8017377 seq id no.36 6.59 mmab rs7134594 seq id no.37 6.92 ednra rs5335 seq id no.38 7.10 hey2 rs9388451 seq id no.39 7.17 serpinc1 rs121909548 seq id no.40 7.72 alox5ap rs10507391 seq id no.41 7.94 f2 rs1799963 seq id no.42 9.02 atp2b1 rs7136259 seq id no.43 9.19 pros1 rs121918474 seq id no.44 9.28 cdkn2b-as1 rs4977574 seq id no.45 9.48 scn5a rs11720524 seq id no.46 10.00 cyp11b2 rs1799998 seq id no.47 10.40 thsd7a rs17165136 seq id no.48 11.42

26、在本发明一个或多个实施例中，所述试剂盒还可以包括sap反应试剂、延伸反应试剂等本领域技术人员所熟知的反应试剂。所述sap反应试剂一般包括sap酶、sap缓冲液等。所述延伸反应试剂一般包括延伸酶、延伸缓冲液、延伸终止液等。

27、本发明还提供了一种非诊断目的核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的方法，所述方法包括：将所述的直接扩增试剂、扩增引物加入样本进行直接扩增反应，经sap反应后再加入所述的延伸引物进行延伸反应，对得到的延伸产物进行质谱检测。如图1所示，本发明利用所述的直接扩增试剂实现了对血液样本、血卡样本的直接扩增，无需样本提取步骤，在一管反应中实现对16个位点的目标序列的同时扩增；经过sap反应去除体系中多余的dntp；然后将设计的特异性延伸引物加入到体系中，使得延伸引物与模板序列特异性结合，并完成单碱基延伸反应；在质谱检测中，对目标位点延伸产物片段进行检测，通过质谱图中不同延伸引物峰及延伸峰对应的分子量，来判断基因多态性检测结果。

28、在这里，所述样本应理解为含有或推测含有核酸的任何物质，包括从个体分离的组织或流体，或其纯化部分，例如体液、组织、体外细胞培养物、血卡等。所述体液包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、痰液、胆汁、滑液、尿液、泪液、精液、乳腺分泌物、唾液、关节液、腹水、胸膜积液、羊水等。所述组织包括全血、正常组织、肿瘤组织，还包括石蜡包埋组织或术后冰冻组织。作为优选，所述样本选自全血或血卡。所述血卡一般为fta血卡，所述fta血卡孔径为0.5-1.2mm，优选为0.5mm。

29、本发明的有益效果：本发明提供了一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，以及含有该直接扩增试剂的用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒及方法。该直接扩增试剂不仅可兼容血液和血卡样本，实现了对这两种样本的直接多重扩增，确保扩增效率；且成分简单，不会对上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果产生负面影响，具有很好的灵敏度、特异性。本发明还将该直接扩增试剂应用于制备用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，所述试剂盒还包括针对核酸质谱检测而创造性设计的扩增引物及延伸引物，仅需1ul全血样本或0.5mm血卡样本，单孔一次检测即可实现16个心脑血管疾病易感基因snp位点的同时检测，有效提高了检测效率及准确率，降低检测成本。