一种嗜盐菌利用挥发性脂肪酸生产PHBV的方法及应用

本发明属于生物化学，尤其涉及一种嗜盐菌利用挥发性脂肪酸生产phbv的方法及应用。

背景技术：

1、当前，传统塑料制品的广泛使用和低回收利用率造成了严重的“白色污染”。传统石化塑料在环境中很难被自然降解，长期积累会对环境造成严重的负担，甚至会形成微塑料通过食物链进入人体，对身体健康造成潜在的危害。因此，为了减少石化塑料带来的污染，亟需寻找新的可生物降解塑料来取代石化塑料。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，pha)具有良好的生物相容性、可生物降解性和结构多样性，被认为是取代石化塑料的理想材料。然而，生产成本过高限制了pha生物塑料在市场中的广泛应用。

2、halomonassp.是一类中等嗜盐菌，可以在盐含量为1～15％的环境中正常生长。近年来，halomonassp.生产pha的研究称为了热点。因为嗜盐菌在高盐浓度下的生长能力，这为细菌提供了一些优势，包括在非无菌条件下生长的能力、防止其他细菌污染的能力、在海水中生长的能力等。这能够避免在pha生产过程中因为对培养基灭菌处理产生的费用，可以降低pha的生产成本。

3、目前已经有近200种不同的pha单体被发现，包括聚羟基丁酸酯[poly(3-hydroxybutyrate)，phb]和聚羟基丁酸戊酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，phbv]等。其中phbv由于具有更加优异的物理性能受到了广泛的关注。在phbv的生产过程中，需要添加形成3hv的前体物质，例如丙酸。然而，丙酸对生产pha的普通微生物具有较强的毒性作用，导致最后获得的phbv产量很低。因此，为了得到高产量的phbv，亟需寻找能够利用高浓度丙酸的微生物。

4、挥发性脂肪酸(vfas)包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等。有机废物的厌氧产酸发酵能够产生大量的挥发性脂肪酸(其中以乙酸、丙酸和丁酸为主)。在厌氧产酸发酵的过程中，通过控制发酵条件可以得到不同组成的vfas。随着生活水平的提高和人口不断的增长，各种有机废弃物的产生量逐年增加，可以为phbv的生产提供源源不断的原料。因此，利用以丙酸为主的挥发性脂肪酸代替葡萄糖等价值较高的原料作为phbv发酵的碳源培养halomonassp.，能够实现提高废弃物资源化利用，降低phbv生产成本的目的。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种嗜盐菌利用挥发性脂肪酸生产phbv的方法及应用。本发明仅以丙酸为主的混合挥发性脂肪酸作为碳源培养halomonassp.yj01，原料可由有机废弃物厌氧产酸发酵获得，可同时达到有机废弃物资源化利用和降低phbv生产成本的目的；本发明在碳氮比为90时得到的phbv含量高达72.63wt％，产量高达2.44g/l，远高于其他碳源的培养效果，因此在工业上具有大规模生产phbv的潜力；使用本发明中的方法在非无菌环境中生产phbv，结果表明仍可得到很高的phbv含量，与无菌环境中无明显差异，说明本发明还可避免由于灭菌所产生的大量耗费。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明提供了一种嗜盐菌利用挥发性脂肪酸生产聚羟基丁酸戊酸酯(phbv)的方法，所述方法仅以挥发性脂肪酸为碳源，碳氮比为(20～120)：1，碳磷比为(100～1000)：1，培养基灭菌或未灭菌；所述嗜盐菌为halomonassp.yj01，保藏号为cgmccno.29716；所述挥发性脂肪酸由乙酸、丙酸和丁酸按照1：4：2的配比组成；所述配比皆为重量配比。

4、进一步的，所述碳氮比为(70～120)：1，碳磷比为(800～1000)：1。

5、更进一步的，所述碳氮比为90：1，碳磷比为1000：1。

6、进一步的，所述培养基的组成为：挥发性脂肪酸18～22gcod/l，(nh4)2so41.8～2.2g/l，nacl38～42g/l，kh2po413.0～13.5g/l，柠檬酸1.6～1.8g/l，mgso4·7h2o0.4～0.5g/l以及微量元素8～12ml/l；所述微量元素的组成为：feso4·7h2o8～12g/l；cuso4·7h2o0.8～1.2g/l；znso4·7h2o2.0～2.5g/l；mnso40.04～0.06g/l；cacl21.8～2.2g/l；na2b4o70.20～0.25g/l；(nh4)6mo7o24·4h2o0.08～0.12g/l；35％hcl8～12ml/l。

7、更进一步的，所述培养基的组成为：挥发性脂肪酸20gcod/l，(nh4)2so42.0g/l，nacl40g/l，kh2po413.3g/l，柠檬酸1.7g/l，mgso4·7h2o0.45g/l以及微量元素10ml/l。

8、再进一步的，所述微量元素的组成为：feso4·7h2o10g/l；cuso4·7h2o1g/l；znso4·7h2o2.25g/l；mnso40.05g/l；cacl22g/l；na2b4o70.239g/l；(nh4)6mo7o24·4h2o0.1g/l；35％hcl10ml/l。

9、进一步的，所述方法的具体步骤为：

10、(1)菌种活化：菌种划线接种至2216e培养基平板，30℃培养24h；

11、(2)种子液培养：在步骤(1)中培养的平板上挑取单菌落，再次接种于2216e液体培养基中，180rpm，30℃培养24h，得到种子培养液；

12、2216e液体培养基可从市面上直接购买，其组成为(g/l)：蛋白胨，5.0；酵母浸粉，1.0；柠檬酸铁，0.1；氯化钠，19.45；氯化镁，5.98；硫酸钠，3.24；氯化钙，1.8；氯化钾，0.55；碳酸钠，0.16；溴化钾，0.08；氯化锶，0.034；硼酸，0.022；硅酸钠，0.004；氟化钠，0.0024；硝酸铵，0.0016；磷酸氢二钠，0.008。

13、(3)phbv生产：将步骤(2)中获得的种子培养液以2％的接种量接种在所述phbv生产培养基中进行发酵。

14、发酵温度可为20～28℃，优选为25℃；

15、发酵初始ph值可为7～9，优选为8；

16、发酵时间可为60～80h，优选为72h；

17、发酵模式采用摇瓶发酵，摇床转速可为150～220rpm，优选为180rpm。

18、本发明还提供了一种所述方法在有机废弃物资源化利用中的应用。

19、本发明还提供了一种所述方法在聚羟基脂肪酸酯(pha)生产中的应用。

20、进一步的，所述应用具体为在聚羟基丁酸戊酸酯(phbv)生产中的应用。

21、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

22、本发明仅以丙酸为主的混合挥发性脂肪酸作为碳源培养halomonassp.yj01，原料可由有机废弃物厌氧产酸发酵获得，可同时达到有机废弃物资源化利用和降低phbv生产成本的目的；本发明在碳氮比为90时得到的phbv含量高达72.63wt％，产量高达2.44g/l，远高于其他碳源的培养效果，因此在工业上具有大规模生产phbv的潜力；使用本发明中的方法在非无菌环境中生产phbv，结果表明仍可得到很高的phbv含量，与无菌环境中无明显差异，说明本发明还可避免由于灭菌所产生的大量耗费。

23、保藏证明说明：

24、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

25、保藏编号：cgmccno.29716；

26、保藏日期：2024年01月22日；

27、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

28、分类学命名：盐单胞菌(halomonassp.)。