基于细胞外基质的导电水凝胶、制备方法及应用与流程

本发明涉及生物材料，尤其涉及一种基于细胞外基质的导电水凝胶、制备方法及应用。

背景技术：

1、电刺激等物理干预在组织微环境中具有不可或缺的作用，往往被忽视。有创伤导致微环境的破坏，影响组织的修复。电刺激(es)作为一种非药物干预手段，因其在调节细胞活性和促进组织修复方面的卓越能力而受到广泛关注。目前es疗法的广泛应用主要受到笨重的外部设备和复杂的操作管理的限制。

2、水凝胶由于其具有良好的可塑性和生物相容性，在生物工程领域获得越来越多的关注。导电水凝胶是一种具有广泛生物应用潜力的材料，其在医学、生物传感、组织工程等领域具有重要的应用价值。

3、然而，虽然已经取得了一些显著的进展，但导电水凝胶仍然存在一些技术缺陷和挑战。目前大部分研究为了增强水凝胶的导电性，加入大量导电聚合物，如碳化钛(mxene)，聚吡咯(ppy)等。这类高分子导电聚合物通常在体内难以降解，在体内积聚，生物相容性不理想。此外，为了追求机械性能，这类复合水凝胶为各种高分子材料组成，仅能在体外应用，无法满足组织重建的降解性要求，粘附性差，限制了其在组织工程领域的应用

4、目前针对相关技术中存在的生物相容性差、粘附性不佳、不可降解等问题，尚未提出有效的解决方案。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于细胞外基质的导电水凝胶、制备方法及应用，以解决相关技术中存在的生物相容性差、粘附性不佳、不可降解等问题。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

3、第一方面，提供一种基于细胞外基质的导电水凝胶的制备方法，用于骨缺损修复，包括：

4、添加细胞外基质、具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶、光引发剂至pbs缓冲液，并混合，以获得复合水凝胶前驱体；

5、添加多巴胺修饰的黑磷纳米片至所述复合水凝胶前驱体，并混合，以获得导电水凝胶前驱体；

6、对所述导电水凝胶前驱体进行光固化，以获得导电水凝胶。

7、在其中的一些实施例中，在所述复合水凝胶前驱体中，所述具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶的浓度为0～5％w/v。

8、在其中的一些实施例中，在所述复合水凝胶前驱体中，所述细胞外基质与所述具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶的质量比为1：1。

9、在其中的一些实施例中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。

10、在其中的一些实施例中，所述光引发剂的浓度为0～1％。

11、在其中的一些实施例中，在所述导电水凝胶前驱体中，所述多巴胺修饰的黑磷纳米片的浓度为0～30％w/v。

12、在其中的一些实施例中，混合的温度为室温。

13、在其中的一些实施例中，光固化的条件为405nm、15～30s。

14、在其中的一些实施例中，制备具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶包括：

15、将甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶与edc/nhs溶液交联，以获得第一混合溶液；

16、对所述第一混合溶液进行分离纯化，以获得具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶。

17、在其中的一些实施例中，制备多巴胺修饰的黑磷纳米片包括：

18、添加黑磷纳米片至含有多巴胺的tris溶液，并混合，以获得第二混合溶液，其中，所述第二混合溶液的ph＞7；

19、对所述第二混合溶液分离纯化，以获得多巴胺修饰的黑磷纳米片。

20、在其中的一些实施例中，包括：

21、(一)制备细胞外基质

22、将动物源的脂肪组织在含有10mm tris和5mm edta的冷冻缓冲液中用三个循环冷冻解冻，其中，循环的温度为-80℃～37℃；

23、使用pbs缓冲液冲洗脂肪组织三次；

24、使用酶消化溶液消化脂肪组织，其中，酶消化溶液由0.25％胰蛋白酶/0.02％edta组成；

25、在37℃的摇床上以1000rpm孵育过夜；

26、使用99.9％异丙醇对脂肪组织进行12小时极性溶剂萃取以去除脂肪液体部分；

27、使用pbs缓冲液对脂肪组织漂洗三次，其中，pbs缓冲液的ph为7.4；

28、将脂肪组织在酶消化溶液中再次孵育4h；

29、使用pbs缓冲液对脂肪组织洗涤三次；

30、将脂肪组织在含有10mg/ml的dnase酶、10mg/mlrnase酶和2000u/ml脂肪酶的溶液中37℃下孵育6小时；

31、使用pbs缓冲液对脂肪组织漂洗三次；

32、将脂肪组织在99.9％异丙醇中再次处理8h，作为最终的极性溶剂萃取以充分去除脂肪，以得到细胞外基质；

33、使用75％乙醇、pbs缓冲液分别对细胞外基质洗涤三次；

34、使用乙酸溶解细胞外基质，洗涤，调节ph值为7.4，然后并冷冻干燥，以获得细胞外基质；

35、(二)制备具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶

36、将甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶用过量的edc/nhs水溶液于室温下交联2h；

37、使用2000道尔顿的透析膜进行透析24h；

38、冷冻干燥，以获得具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；

39、(三)制备黑磷纳米片

40、将研磨后的黑磷晶体加入n-甲基吡咯烷酮，冰浴超声24h，以获得分散液；其中，黑磷晶体与n-甲基吡咯烷酮的质量体积比为1：5；

41、将分散液以2000rpm离心10min，以获得上清液；

42、将上清液以13000rpm离心10min，以获得第一粗产物；

43、使用乙醇、超纯水对第一粗产物分别洗涤三次，以获得黑磷纳米片；

44、(四)制备多巴胺修饰的黑磷纳米片

45、将黑磷纳米片添加到含有多巴胺的tris溶液，并使用氢氧化钠溶液预调节至ph＝8.5，剧烈搅拌4h，以获得混合液；

46、将混合液以13000rpm离心10min，以获得第二粗产物；

47、使用超纯水对第二粗产物洗涤，以获得多巴胺修饰的黑磷纳米片；

48、(五)制备导电水水凝胶

49、将细胞外基质、具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶混合；

50、使用浓度为0.25％的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂将细胞外基质、具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶解于pbs缓冲液，于室温下搅拌1h，以得到复合水凝胶前驱体，其中，具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶的浓度为1％w/v，细胞外基质与具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶的质量比为1：1；

51、添加多巴胺修饰的黑磷纳米片至复合水凝胶前驱体，于室温下搅拌，以得到导电水凝胶前驱体，其中，多巴胺修饰的黑磷纳米片的浓度为5％w/v、10％w/v、15％w/v、20％w/v；

52、将导电水凝胶前驱体暴露于405nm下15～30s进行光固化，以得到导电水凝胶。

53、第二方面，提供一种基于细胞外基质的导电水凝胶，由第一方面所述的制备方法制备而成，包括：

54、细胞外基质；

55、具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；

56、多巴胺修饰的黑磷纳米片。

57、在其中的一些实施例中，所述细胞外基质与具有活化羧基的甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶的质量比为1：1。

58、在其中的一些实施例中，所述多巴胺修饰的黑磷纳米片与所述细胞外基质的质量比为0～30：1。

59、在其中的一些实施例中，所述导电水凝胶的粘度为50～100pa.s。

60、在其中的一些实施例中，所述导电水凝胶的电导率为0.04～0.10s/m。

61、在其中的一些实施例中，所述导电水凝胶的孔径为50～200μm。

62、第三方面，提供一种如第一方面所述的的制备方法制备得到的导电水凝胶或如第二方面所述的导电水凝胶在制备骨缺损修复材料的应用。

63、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

64、本发明的一种基于细胞外基质的导电水凝胶、制备方法及应用，该复合水凝胶由天然成分组成，具有优异的生物相容性和可降解性；具有优异的可注射性和粘性，适合不同形状的骨缺损并良好附着，注射后快速光固化；该水凝胶中黑磷具有可降解性，体内可降解为磷酸根成分，为成骨提供原材料；有优异的导电性能，可通过外源性电场干预，重塑组织电化学微环境，促进组织修复。