一种构建含有mRNA体外转录元件的通用型mRNA体外转录模版骨架的制作方法

本发明属于纳米生物预防医学领域，具体涉及一种含有mrna体外转录元件的mrna体外转录模版的构建及其在mrna序列优化中的应用。

背景技术：

1、mrna疗法在传染性疾病预防和癌症免疫治疗领域具有重大前景，其在应对这些医学挑战方面的潜力在30多年就得到了认可。2018年美国食品药品监督管理局（fad）批准了首个具有里程碑意义的mrna治疗药物onpattro™，用于治疗遗传性淀粉样变性，标志着一个关键时刻，正式将mrna疗法引入制药市场。2020美国紧急获批上市的两款mrna疫苗，重新点燃了人们对mrna治疗技术的研究兴趣和探索。

2、mrna疫苗的成功研发和应用关键取决于两项技术的突破：体外转录（ivt）中的mrna结构序列的优化和化学性修饰，以及高效mrna递送载体的设计和发现。其中mrna 序列的设计和优化是mrna疗法中最为核心和关键的方面，也和mrna疗法效果和mrna疫苗的预防性密不可分。序列的设计和优化至关重要，它影响mrna体外转录的产量，mrna分子的免疫原性，翻译效率和mrna分子的稳定性。mrna序列设计的目的主要是提高蛋白表达的强度，增加蛋白的存留时间，减少mrna分子的使用剂量，降低药物的成本。

3、目前rna的序列可以通过多种方式获取，体外转录技术（in vitro transcribed,ivt）在mrna序列的获取中最为广泛，ivt mrna是指以dna为模板,由rna聚合酶在无细胞体系下催化转录出的mrna。ivt mrna序列包括五个部分5＇cap（帽子结构）、5＇utr（非编码区域）、orf（编码蛋白的开放阅读框）、3＇utr（非编码区域）和3＇poly a尾巴（多聚腺苷酸尾巴），帽子结构可以参与阻止ivt mrna被核酸外切酶降解，降低mrna的免疫原性，调解mrna的半衰期以及翻译调控等过程，现已有专门的加帽试剂盒可以对ivt mrna进行体外加帽，5＇utr和3＇utr参与调控翻译，增加mrna稳定性，辅助蛋白产物的定位，因此需要对其序列进行针对性的优化和选择，orf的设计设计密码子的优化及信号肽的选择。

4、基于以上的要求，本发明设计了一种具备ivt mrna所必须元件通用型质粒载体骨架

5、用于制备副作用更低免疫原性更高的mrna疫苗及mrna治疗性药物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建一种含有mrna体外转录必须原件的通用型骨架，在于通过采用相关抗原的基因序列的替换增加mrna疫苗及mrna药物的泛用性，同时可增强相关目的蛋白的表达量，减少在体内潜在的副作用，借助通用型的骨架可进一步加快对多种传染性疾病的研发。

2、在本发明的第一方面，提供了一种通用型骨架的用途，所述泛用性骨架用于构建mrna转录本，其中，所述转录本包括待表达的orf序列以及位于所述orf序列两侧的5＇utr区域和3＇utr区域，其中所述5＇utr区域和3＇utr区域中可替换为其他高表达蛋白的不同物种基因的utr。

3、在另一优选例中，所述的mrna转录本包括mrna疫苗中的mrna转录本。

4、在另一优选例中，所述抗体基因的utr保守序列的核苷酸序列如seqid no：1或3

5、在另一优选例中，所述抗体基因的utr保守序列包括5’抗体保守序列和3’抗体保守序列。

6、在另一优选例中，所述5’抗体保守序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。

7、在另一优选例中，所述3’抗体保守序列的核苷酸序列如seq id no:3所示。

8、在本发明的第二方面，提供了一种通用型骨架，所述通用型骨架具有式i结构：

9、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z8-z9-z10-z11(ⅰ)

10、式中，

11、z1、z3、z5、z7、z9或z11为无或酶切位点；

12、z2为5＇utr区域；

13、z4为信号肽序列；

14、z6为可替换的orf区；

15、z8为3＇utr区域；

16、z10为polya尾部元件。

17、在另一优选例中，所述z1、z3、z5、z7、z9、z11为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。

18、在另一优选例中，所述通用型骨架包括启动子、酶切位点、5＇utr区域、酶切位点、信号肽、酶切位点、orf、酶切位点、3＇utr区域、酶切位点、 polya、酶切位点。

19、在另一优选例中，所述粘性末端酶选自下组：saci、ecori、hindiii、xhoi、或其组合。

20、在另一优选例中，所述z6可替换为选自下组的基因：猫传染性腹膜炎病毒的n蛋白、猫细小病毒的s蛋白、猫瘟病毒的s蛋白、狂犬病毒g蛋白、登革热病毒e蛋白、结核分支杆菌esat-6蛋白、ag85a蛋白、或其组合。

21、在另一优选例中，所述z6可替换为选自下组病原的抗原基因：巨细胞病毒 (cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、 呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病(rabies) 、 艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌 (streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus）疟疾 (malaria) 、岗地弓形虫 (toxoplasmagondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合

22、在另一优选例中，所述z6被替换为猫传染性腹膜炎病毒的n蛋白。

23、在另一优选例中，所述z6经过密码子优化。

24、在另一优选例中，所述z6的替换方法包括同源重组和酶切。

25、在另一优选例中，所述z6的终止密码子为多个终止密码子。

26、在另一优选例中，所述z6的终止密码子为1个终止密码子。

27、在另一优选例中，所述z10的长度较佳地为100nt-150nt，更佳地为110nt-130nt,更佳地为120nt。

28、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的通用型骨架。

29、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述载体为质粒。

30、在另一优选例中，所述载体为pbluscript ks ii(+)载体。

31、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的通用型骨架。

32、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

33、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

34、在本发明的第五方面，提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞含有：如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的通用型骨架，并且含有目的基因片段。

35、在另一优选例中，所述工程化细胞为top10大肠杆菌感受态细胞。

36、在另一优选例中，所述目的基因片段含有ecori和hindiii酶切位点序列。

37、在另一优选例中，所述载体或通用型骨架含有ecori和hindiii酶切位点序列。

38、在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或通用型骨架通过t4连接酶进行基因重组。

39、在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或通用型骨架连接环化。

40、在另一优选例中，所述目的基因选自下组：巨细胞病毒 (cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、 呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病(rabies) 、 艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌 (streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（felineinfectious peritonitis virus）疟疾 (malaria) 、岗地弓形虫 (toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合。

41、在本发明的第六方面，提供了一种用于制备疫苗的mrna的制备方法，即一种mrna的制备方法，且该mrna是用于制备疫苗用的，其包括步骤：

42、(a)在适合的条件下，培养如本发明第六方面所述的工程化细胞，将工程化细胞进行扩大培养，得到培养物，该培养物中含有dna模板的载体；

43、(b) 从所述培养物中分离和/或回收含有dna模板的载体，并酶切为单链dna模板；

44、(c) 将 (b)中所述dna模板纯化回收后进行体外转录，从而获得所述优化目的基因的mrna;

45、(d)任选地，对步骤(c) 获得的优化mrna进行纯化和/或修饰，添加5’帽子。

46、在对优化mrna进行纯化和/或修饰时，采用现有的纯化方法、修饰方法即可。

47、在本发明的第七方面，提供了一种mrna疫苗的制备方法，所述方法包括步骤：

48、(i)通过如本发明第七方面所述的方法获得优化mrna;

49、(ii)将(i)中获得的优化mrna与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mrna疫

50、苗或者mrna治疗性药物。

51、其中，药学上可接受的载体，可采用：如脂质体纳米颗lnp，基因递送载体lipofectamine3000，lipofectamine2000,聚合物纳米颗粒转运体cart，外泌体exostng。

52、在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

53、(a)第一质粒，所述第一质粒含有目的基因；和

54、(b) 第二质粒，所述第二质粒含有如本发明第二方面所述的通用型骨架；和

55、(c) 说明书，所述说明书描述了使用所述第一质粒和第二质粒生产可用于制备疫苗的优化mrna的方法。

56、第二质粒上负载上相关病毒抗原的基因就是第一质粒，第一质粒是包含了特定病毒抗原基因序列的质粒。

57、其中，此处的“目的基因”，是指与该试剂盒所测试内容相对应的基因或序列。比如，若为新冠病毒试剂盒，则目的基因即为与新冠病毒相匹配的基因或序列。工程化细胞处记载的目的基因，同理。

58、在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用第一质粒为模板扩增出带有相同酶切位点序列的第一片段的方法。

59、在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用相同酶切位点双酶切第二质粒获得mrna体外转录必须元件的序列片段的方法。

60、在另一优选例中，所述说明书中还记载了将所述第一片段和所述第二片段通过t4连接酶连接环化并转入一合适的宿主细胞的方法。

61、在另一优选例中，所述说明书中还记载了从所述宿主细胞获得优化mrna的方法。

62、在本发明的第九方面，提供了一种mrna疫苗组合物，所述疫苗组合物含有：

63、(a) 用于表达免疫原的mrna,所述mrna包含如本发明第二方面所述的泛用性骨架；和

64、(b)药学上可接受的载体。

65、巨细胞病毒 (cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、 呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病(rabies) 、 艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus）疟疾(malaria) 、岗地弓形虫 (toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合

66、在另一优选例中，所述疫苗组合物中mrna本身还可以充当佐剂。

67、在另一优选例中，所述疫苗组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。

68、在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99%的如本发明第二方面所述的通用型骨架和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。

69、在本发明的第十方面，提供了一种如本发明第九方面所述的mrna疫苗组合物， 或如本发明第五方面所述的工程化细胞的用途，其被用于制备一药物，所述药物用于预防选自下组的病原体：巨细胞病毒 (cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、 呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病(rabies) 、 艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus）、疟疾(malaria) 、岗地弓形虫 (toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合。

70、本发明的有益效果在于，提供了一种通用型质粒骨架，通过构建带有可替换orf模板骨架的质粒，能够加快mrna疫苗的研发速度；通过在mrna体外转录必须元件上添加酶切位点可替换选择合适的utr，信号肽和polya尾作为通用型质粒骨架的可变部分，根据不同的抗原序列选择最优组合元件，增强了mrna的稳定性和翻译活性，主要是保证了该质粒骨架的通用型性和 mrna疫苗的稳定性。