一种纯化Sox2蛋白的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种纯化sox2蛋白的方法。

背景技术：

1、cn104962531a公开了一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，以牛乳清为原料，采用硫酸铵盐析方法分离牛乳清中乳过氧化物酶，具体方法为向乳清中添加一定饱和度的硫酸铵，经过一段时间使乳过氧化物酶沉淀，离心使乳过氧化物酶完全沉淀，收集沉淀即获得乳过氧化物酶，将沉淀复溶，经超滤膜去除小的杂蛋白，进一步纯化乳过氧化物酶，通过透析袋脱盐处理，然后冷冻干燥，从而制备出高活性的可用于天然食品添加剂的乳过氧化物酶产品。

2、cn103740689b公开一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，该方法通过以下工艺步骤：(1)多重结晶；(2)活化；(3)盐析；(4)超滤；(5)热原处理；(6)透析；(7)亲和层析；(8)冻干，制备糜蛋白酶。本发明对糜蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的糜蛋白酶的效价高达1500～1800iu/mg，并且各项指标均符合中国药典规定。

3、cn102911926a涉及采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括生产用原料获取，原料粉碎、提取蛋白，分级盐析、酶原沉淀，粗品酶解，亲和层析分离纯化，超滤浓缩除菌，真空冷冻干燥得到成品。与现有技术相比，本发明体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。

4、cn106754841a涉及一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，以牛胰或猪胰为原料，包括以下步骤：原料粉碎；胰蛋白粗提；硫酸铵两级盐析；粗品酶解活化；以ge health凝胶介质sepharose cl 4b为骨架，以(2,6二羟基)庚基(6氨基)乙酰基对氨基苯基胍为配基，在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析；超滤浓缩除菌；真空冷冻干燥得成品。该发明规避了传统工艺中繁琐的酶原沉淀步骤，大大简化了工序，同时能以较高的收率获得高纯度高活性的产品，工艺稳定，质量可控，大幅降低了生产成本，提高了产品的市场竞争力。

5、cn109307771a涉及亲和层析定量检测重组人α干扰素生产工艺中间体含量的方法，包括：1)表达重组人α干扰素的工程菌构建；2)发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白。其中蛋白纯化包括粗纯和精纯，利用硫酸铵盐析沉淀获得蛋白粗品，粗品经deae阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。本方法适于重组人α干扰素和重组集成干扰素生产工艺中间体的定量检测，优点是操作简单、快速、准确，根据得到的干扰素浓度数据可以改进人们对生产过程的认知程度和控制程度，使得可靠、快速、直接、容易地评估干扰素生产关键环节成为可能，以实现精确质量控制的目的。

6、转录因子sox2是sox区域y相关hmg(high mobility group)蛋白家族成员之一。sox蛋白家族在哺乳动物器官早期发育中发挥重要的作用，尤其是转录因子sox2。sox2是调节哺乳动物胚胎发育的必要因子之一。sox2作为转录因子，对其在调控机理、抗体以及医学中的应用等研究的比较多，对于其表达后的纯化工艺研究的资源极为稀缺。随着层析技术的成熟，有力推动了蛋白纯化的发展。整体来讲，sox2蛋白的纯化集中在柱层析技术方面。

7、现有技术(张琦等.“人sox2基因的克隆表达和纯化”.华中师范大学学报：自然科学版42.1(2008):4.)中，人源sox2蛋白通过大肠杆菌bl23(de3)进行扩增和表达，将所获得包涵体通过含有8m urea的缓冲体系裂解。然后在层析柱上进行纯化和复性，柱层析使用的介质是ni sepharose 6fast flow instruction(ge)，复性后蛋白得率为0.7mg/g湿菌重。

8、采用上述方法制备人源sox2蛋白的不足在于：(1)8m urea体系不易配制，无法实现在温控严格的gmp车间放大工艺。(2)产率仅为0.7mg/g湿菌重，产率低。在包涵体洗涤环节，采用1m urea进行除杂，这个步骤也会损失大量目的蛋白，从而影响收率。(3)生产成本高，8m urea体系及ge介质均增加了生产成本。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中纯化人源sox2蛋白时，成本高、纯化使用的缓冲液体系难配制、无法实现在温控严格的gmp车间中放大工艺以及sox2蛋白收量低的缺陷，提供一种纯化sox2蛋白的方法。本发明提供的方法具有成本低廉、操作简单、缓冲液体系好配制、经纯化后的sox2蛋白收量高、纯度高的优点，具有广泛的应用前景。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明第一方面提供一种纯化sox2蛋白的方法，所述方法包括使用盐析来纯化sox2蛋白的步骤。

4、本发明一些实施方案中，所述盐析为分级盐析。

5、本发明一些实施方案中，所述盐析使用的盐为硫酸铵。

6、本发明一些较佳的实施方案中，所述分级盐析为两级盐析。

7、本发明一些更佳的实施方案中，所述两级盐析中硫酸铵的浓度分别为20-25％和25-30％。

8、本发明一些实例中，所述两级盐析中硫酸铵的浓度分别为25和30％。

9、本发明一些实施方案中，所述盐析在0-4℃进行。

10、本发明一些实施方案中，所述方法还包括亲和层析的步骤。

11、本发明一些较佳的实施方案中，所述亲和层析为镍亲和层析。

12、本发明一些更佳的实施方案中，所述镍亲和层析使用nw rose ni ff介质。

13、本发明一些实施方案中，所述亲和层析包括以下步骤：

14、(1)前平衡；使用的平衡缓冲液包含尿素、pb、nacl和/或咪唑；

15、(2)上样；

16、(3)后平衡；使用的平衡缓冲液包含尿素、pb、nacl和/或咪唑；

17、(4)洗涤；使用的洗涤缓冲液包含尿素、pb、nacl、咪唑和/或triton x-114；

18、(5)洗脱；使用的洗脱缓冲液包含尿素、pb、nacl和/或咪唑。

19、本发明一些较佳的实施方案中，(1)和(3)中使用的平衡缓冲液包含5-6m尿素、5-20mm pb、50-300mm nacl和2-5mm咪唑；

20、(4)中所述洗涤为三步洗涤；和/或，

21、(5)中使用的洗脱缓冲液为5-6m尿素、5-20mm pb、200-500mm nacl和400-500mm咪唑；

22、本发明一些更佳的实施方案中，(2)中所述的三步洗涤使用的洗涤缓冲液分别包含5-6m尿素、5-20mm pb、800-1000mm nacl和2-10mm咪唑；5-6m尿素、5-20mm pb、50-300mmnacl、2-10mm咪唑和0.1％-0.2％tritonx-114；和，5-6m尿素、5-20mm pb、50-300mm nacl和10-20mm咪唑。

23、本发明一些实施方案中，(1)中使用的平衡缓冲液为5-10个柱体积；(3)中使用的平衡缓冲液为3-5个柱体积；(4)中所述的三步洗涤使用的洗涤缓冲液分比为5-10个柱体积、5-10个柱体积和3-5个柱体积；和/或，(5)中使用的洗脱缓冲液为3-5个柱体积。

24、本发明一些实例中，所述亲和层析包括以下步骤：

25、(1)前平衡：使用的平衡缓冲液包含6m尿素、20mm pb、287mm nacl和5mm咪唑；10个柱体积；

26、(2)上样；

27、(3)后平衡：使用的平衡缓冲液包含6m尿素、20mm pb、287mm nacl和5mm咪唑；5个柱体积；

28、(4)洗涤：

29、(a)高盐洗涤：使用的洗涤缓冲液1包含6m尿素、20mm pb、1000mm nacl和5mm咪唑；10个柱体积；

30、(b)triton洗涤：使用的洗涤缓冲液2包含6m尿素、20mm pb、287mm nacl、5mm咪唑和0.2％ tritonx-114；10个柱体积；

31、(c)终洗涤：使用的洗涤缓冲液3包含6m尿素、20mm pb、200mm nacl和20mm咪唑；5个柱体积；

32、(5)洗脱：使用的洗脱缓冲液6m尿素、20mm pb、500mm nacl和500mm咪唑。

33、本发明一些实施方案中，所述方法满足以下条件的一种或多种：

34、所述平衡缓冲液的ph为7-8.2；

35、所述洗涤缓冲液的ph为7-8.2；

36、所述洗脱缓冲液的ph为7-8.2。

37、本发明第二方面提供一种如第一方面所述的方法，所述sox2蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，或与其具有至少90％的同一性。

38、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

39、本发明所用试剂和原料均市售可得。

40、本发明的积极进步效果在于：

41、本发明提供的方法具有成本低廉、操作简单、缓冲液体系好配制、经纯化后的sox2蛋白收量高(可达6.98mg/g蛋白/菌体)、纯度高(可达98.3％)的优点，具有广泛的应用前景。