一种递送核酸药物的氨基酸修饰聚(β-氨基酯)-聚乙二醇载体的制备方法与应用

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种递送核酸药物的氨基酸修饰聚(β-氨基酯)-聚乙二醇载体的制备方法与应用。

背景技术：

1、基因治疗是一种将特定治疗基因如dna、sirna或mirna等通过特定手段转移到特定的细胞中的治疗方法，具有良好的临床疗效和安全性。到2023年，美国食品和药物管理局已批准了六种药物。最近，候选药物如来泊地西兰(lepodisiran)和sig12d-loder已进入临床阶段，并显示出良好的效果。然而，临床中基因的递送仅限于n-乙酰半乳糖胺和脂质纳米颗粒，如何高效地将基因运送到靶点仍是一个尚未解决的难题。受载体的限制，基因药物仅限于肝脏适应症，阻碍了在癌症等更常见疾病中的临床广泛应用。

2、阳离子聚合物是非基因载体中最有潜力的类型，但pei、和等具有高递送和转染效率的商业制剂大多以阳离子脂质为基础，体内毒性较高，无法生物降解，不适合临床使用。聚(β-氨基酯)[poly(β-amino ester)s,pbaes]具有结构多样性、配体特异性摄取能力、可促进内体逃逸的缓冲能力、酯键水解产生的生物降解性、低细胞毒性和优良的转染能力等优点。pbaes出色的基因转染性能引起了研究者的兴趣,近些年来pβaes用于基因递送的报道逐渐增多。但目前的pbaes生理环境下亲水性不高、胺基密度较低、环境响应性不足，难以单独利用，因此其两亲性改性物的研究有较大的发展前景。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种聚(β-氨基酯)两亲共聚物的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的聚(β-氨基酯)两亲共聚物。

3、本发明的再一目的在于提供所述聚(β-氨基酯)两亲共聚物的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种聚(β-氨基酯)两亲共聚物的制备方法，包括如下步骤：将亲水性高分子端基改性为双键，通过迈克尔加成反应增长碳链逐步生成聚(β-氨基酯)，再使用偶联催化剂活化聚(β-氨基酯)的氨基，与阳离子氨基酸发生酯化反应生成聚(β-氨基酯)两亲共聚物。

6、所述的亲水性高分子为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种；优选为聚乙二醇；进一步优选为分子量(平均分子量)600～20000的聚乙二醇；再进一步优选为分子量2000～10000的聚乙二醇；更进一步优选为聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和聚乙二醇10000中的至少一种。

7、所述的偶联催化剂为酰化催化剂；优选为1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hobt/hbtu)，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)，或二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(dcc/dmap)，或三乙胺和n-羟基琥珀酰亚胺(三乙胺/nhs)；优选为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(dcc/dmap)。

8、所述的阳离子氨基酸为赖氨酸、组氨酸、精氨酸、氟氨酸和l-β-亮氨酸中的至少一种；优选为组氨酸。

9、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物优选为聚(β-氨基酯)两亲共聚物pph2k、pph5k和pph10k中的至少一种；其中，

10、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物pph2k、pph5k和pph10k通过如下方法合成得到：

11、(1)在冰浴条件下，将聚乙二醇溶解到二氯甲烷中，通入保护性气体后滴加丙烯酰氯，于65±5℃条件下搅拌回流反应，待反应结束后透析、旋转蒸发获得丙烯酸酯修饰的聚乙二醇；然后在保护性气体条件下，将4-氨基-1-丁醇和己二酸二乙烯酯加入到含有丙烯酸酯修饰的聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，搅拌反应，待反应结束后再次透析、旋转蒸发干燥，得到聚乙二醇-聚(β-氨基酯)；其中，所述的聚乙二醇的分子量为2000、5000或10000；

12、(2)将n-苄氧羰基组氨酸、n,n'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入含有步骤(1)中得到的聚乙二醇-聚(β-氨基酯)的二甲基亚砜溶液中，搅拌反应，得到酯化产物(聚乙二醇-聚(β-氨基酯)-cbz-组氨酸)；然后将酯化产物加入到水中，弃去沉淀，旋转蒸发干燥，得到聚乙二醇-聚(β-氨基酯)-cbz-组氨酸；再将聚乙二醇-聚(β-氨基酯)-cbz-组氨酸重新溶解到四氢呋喃中，加入环己烯和钯碳，通入保护性气体达到饱和后，于65±5℃条件下进行冷凝回流反应，待反应结束后经柱层析纯化、浓缩，得到聚(β-氨基酯)两亲共聚物pph2k、pph5k或pph10k。

13、步骤(1)中所述的聚乙二醇、丙烯酰氯、4-氨基-1-丁醇和己二酸二乙烯酯的摩尔比为(1～1.5)：1：(10～15)：(10～15)；优选为1.1:1:11:11。

14、步骤(1)中所述的二氯甲烷的用量为按每毫摩尔聚乙二醇配比50毫升二氯甲烷计算。

15、步骤(1)和(2)中所述的保护性气体优选为氮气。

16、步骤(1)中所述的回流反应的时间为24h以上；优选为24～48h。

17、步骤(1)中所述的透析为采用截留分子量500～8000da的透析袋透析6～72h；优选为采用截留分子量1000da的透析袋透析24h。

18、步骤(1)中所述的含有丙烯酸酯修饰的聚乙二醇的二氯甲烷溶液中丙烯酸酯修饰的聚乙二醇的浓度为0.5～100mmol/l；优选为20mmol/l。

19、步骤(1)中所述的透析所用的透析液均为蒸馏水。

20、步骤(1)和(2)中所述的搅拌反应的时间为48h以上；优选为48～72h。

21、步骤(1)中所述的再次透析为采用截留分子量500～8000da的透析袋透析6～72h；优选为采用截留分子量3000da的透析袋透析72h。

22、步骤(2)中所述的n-苄氧羰基组氨酸、n,n'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙二醇-聚(β-氨基酯)的摩尔比为1：(0.7～2)：(0.7～2)：(0.05～0.5)；优选为1:1:1：0.09。

23、步骤(2)中，含有聚乙二醇-聚(β-氨基酯)的二甲基亚砜溶液中的聚乙二醇-聚(β-氨基酯)的浓度为10～15mmol/l；优选为13.2mmol/l。

24、步骤(2)中所述的水优选为蒸馏水。

25、步骤(2)中所述的水的用量为按每克酯化产物配比150～300毫升水计算；优选为按每克酯化产物配比190～200毫升水计算。

26、步骤(2)中所述的环己烯的用量为按其在反应体系的终浓度为体积百分比0.25％～25％添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为体积百分比5％添加计算。

27、步骤(2)中所述的钯碳的用量为按其在反应体系的终浓度为0.01～0.1g/ml添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为0.05g/ml添加计算。

28、步骤(2)中所述的四氢呋喃的用量为按每100毫升四氢呋喃配比6～8mmol聚乙二醇-聚(β-氨基酯)-cbz-组氨酸计算。

29、步骤(2)中所述的冷凝回流反应的时间为8h以上；优选为8～16h。

30、步骤(2)中所述的柱层析为硅胶柱层析；其中，硅胶的目数为200目，洗脱溶液为氯仿和乙酸乙酯按体积比2：1混合得到的溶液。

31、一种聚(β-氨基酯)两亲共聚物，通过上述任一项所述的方法制备得到。

32、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物在制备基因载体(基因递送载体或核酸药物递送载体)和/或抗肿瘤药物中的应用。

33、所述的基因为反义寡核苷酸(aso)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、环状rna(circrna)、长非编码rna(lncrna)、小激活rna(sarna)、crispr/cas系统和质粒dna(pdna)中至少一种。

34、所述的小干扰rna(sirna)包括具有沉默功能的小干扰rna；优选为针对alk(间变性淋巴瘤激酶)基因的sialk，其序列如下：

35、正义rna(senserna)：5’-ucagcaaauucaaccacca-dtdt-3’；

36、反义rna(antisense rna)：5’-uggugguugaauuugcuga-dtdt-3’。

37、一种聚(β-氨基酯)两亲共聚物/基因纳米复合物，通过如下方法制备得到：将上述聚(β-氨基酯)两亲共聚物配制成聚(β-氨基酯)两亲共聚物溶液，然后加入基因(药物)，室温搅拌形成稳定复合物，得到聚(β-氨基酯)两亲共聚物/基因纳米复合物。

38、所述的配制成聚(β-氨基酯)两亲共聚物溶液所用的溶剂为水或pbs缓冲溶液；优选为ph值为7.2～7.4的pbs缓冲溶液。

39、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物溶液的浓度为0.5～5mg/ml；优选为1mg/ml。

40、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物和基因的氮/磷摩尔比为(0.1～100)：1；优选为40:1。

41、所述的基因为反义寡核苷酸(aso)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、环状rna(circrna)、长非编码rna(lncrna)、小激活rna(sarna)、crispr/cas系统和质粒dna(pdna)中至少一种。

42、所述的小干扰rna(sirna)包括具有沉默功能的小干扰rna；优选为针对alk基因的sialk，其序列如下：

43、正义rna(senserna)：5’-ucagcaaauucaaccacca-dtdt-3’；

44、反义rna(antisense rna)：5’-uggugguugaauuugcuga-dtdt-3’。

45、所述的搅拌的时间为10分钟～24小时；优选为30min。

46、所述的聚(β-氨基酯)两亲共聚物/基因纳米复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

47、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

48、(1)本发明提供了一种可用于递送的基因的聚(β-氨基酯)两亲共聚物，通过将不同链长的聚乙二醇一端烯烃改性，加入4-氨基-1-丁醇和己二酸二乙烯酯进行迈克尔加成反应，合成聚乙二醇-聚(β-氨基酯)共聚物，再在氨基上偶联组氨酸，增强聚合物阳离子密度，使聚(β-氨基酯)两亲共聚物在基因传递领域有潜在应用价值。

49、(2)本发明中将聚(β-氨基酯)两亲共聚物静电连接小干扰rna，利用氨基的正电荷与疏水内核对小干扰rna进行物理包埋，提供了一种递送基因的肿瘤抑制途径，解决了基因稳定性问题，在肿瘤微环境中，聚(β-氨基酯)两亲共聚物可被肿瘤内低ph环境打开，释放包埋的小干扰rna杀伤肿瘤组织，实现抗肿瘤应用。

50、(3)本发明选用亲水性高分子聚乙二醇和可生物降解的聚(β-氨基酯)作为主要原材料，有利于降低产物细胞毒性。不仅反应条件温和、易于操作，而且高效(产率为30％～70％)、具有选择性，有望在生物医学领域发挥其潜在的应用价值。

51、(4)本发明制备的聚(β-氨基酯)两亲共聚物生物相容性好，可生物降解，含有可负载基因的阳离子化疏水内核，可用于负载基因，改善了基因的递送问题，保护了基因的稳定性，具有低细胞毒性，同时具有的肿瘤环境响应性，在治疗癌症和基因传递研究方面显示出良好的应用前景。