一种表达MouseZCWPW2蛋白特定结构域的方法与流程

本发明涉及基因工程，具体而言，涉及一种表达mouse zcwpw2蛋白特定结构域的方法。

背景技术：

1、大肠杆菌表达系统具有成本低，表达快速的优点。但是，大肠杆菌表达系统缺乏适当的翻译后加工机制；因此，目标蛋白容易三维折叠错误而形成包涵体，并导致后续的纯化和回收困难。zcwpw2基因是编码zcwpw2蛋白的基因，研究表明，zcwpw2可以被招募到prdm9的结合位点，在双链断裂的形成或修复中起重要作用。对zcwpw2基因的研究有助于深入了解生殖细胞发育的机制，为相关疾病的诊断和治疗提供重要参考。zcwpw2具有单位三维结构灵活多变，易与染色质的荷电区域和疏水区域结合的特点，导致zcwpw2纯化困难。迄今为止，市场上尚未有mouse zcwpw2表达的专利和相关蛋白出售，表明该蛋白的表达和纯化困难。

2、综上所述，经过申请人的海量检索，本领域至少存在mouse zcwpw2蛋白难以表达和纯化，因此，需要开发或者改进一种表达mouse zcwpw2蛋白特定结构域的方法。

技术实现思路

1、基于此，为了解决mouse zcwpw2蛋白难以表达和纯化的问题，本发明提供了一种表达mouse zcwpw2蛋白特定结构域的方法，具体技术方案如下：

2、一种表达mouse zcwpw2蛋白特定结构域的方法，其包括以下步骤：

3、以包含mouse zcwpw2蛋白序列为模板，然后设计引物进行pcr扩增，得到pcr扩增后的mouse zcwpw2基因片段；

4、在alp_pet_sthis_mbp空载体中，在多克隆位点的n端依次设计了strep tag ii亲和标签、8x his亲和标签、mbp促溶标签和hrv3c八肽酶切位点，得到表达载体alp_pet_sthis_mbp；

5、将所述pcr扩增后的mouse zcwpw2基因片段进行凝胶电泳，然后进行切胶回收，然后与所述表达载体alp_pet_sthis_mbp同时进行bamhi和ecori双酶切，得到双酶切后片段和双酶切后载体；

6、将所述双酶切后片段和双酶切后载体进行切胶回收，然后使用同源重组进行连接，得到连接产物，所述双酶切后片段摩尔量与所述双酶切后载体摩尔量之比为4～6：1；

7、将所述连接产物全部转化至dh5α感受态中，转化后将转化产物全部涂在终浓度为30～70μg/ml的kana抗性lb固体平皿上，得到连接单菌落；

8、将所述连接单菌落进行菌落pcr，然后接种于浓度为30～70μg/ml的kana抗性lb液体培养基中进行菌落培养，得到pcr菌液，将所述pcr菌液进行质粒提取，然后进行测序，结果正确后得到构建成功的质粒；

9、将所述质粒进行诱导表达，得到表达后菌液；

10、将所述表达后菌液进行纯化，得到所述mouse zcwpw2蛋白特定结构域。

11、进一步地，所述诱导表达包括以下步骤：

12、将所述质粒转化至大肠杆菌表达菌株codon plus感受态中，然后将转化产物涂在终浓度为30～70μg/ml的kana抗性lb固体平皿上，然后在35～39℃培养16～24h，得到质粒单菌落；

13、取所述质粒单菌落接种在终浓度为30～70μg/ml的kana抗性lb液体培养基中，然后在35～39℃培养16～24h，然后在35～39℃扩大培养至od600＝0.6～0.8，然后置于自来水中冷却至室温，然后加入终浓度为0.5～1.0mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在12～16℃诱导表达16～24h，得到所述表达后菌液。

14、进一步地，所述纯化包括以下步骤：

15、将所述表达后菌液在3～5℃下以3500～4500rpm的速度离心，收集沉淀菌体，然后将所述沉淀菌体破碎裂解，裂解后离心取上清液，对所述上清液进行ni亲和层析，然后使用sthisfl_gst_precission3c酶进行透析酶切，然后进行ni亲和层析，得到所述mousezcwpw2蛋白特定结构域。

16、进一步地，所述mouse zcwpw2蛋白表达氨基酸序列为：

17、engykfvysqlplgslvlvklrnwpswpgilcpdpfkgkyvtydqdgnvekyyveflgdp hstawmsaafvghfsltleaadctkkkrwyrsaleeayqlyrcsaeqrlevcclsgs。

18、进一步地，所述pcr扩增的引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物为：5’

19、-ggaagttctgttccaggggcccggatccgaaaacggttataaatttgtgtacagccagc-3’，所述反向引物为：5’

20、-gtcgacggagctcgaattcttagctgccgctcaggcagcacacttccaggcgctgttc’；

21、所述菌落pcr的条件为正向引物：5’-ctgatgttcaacctgcaggagccg-3’，反向引物：5’-ccggatatagttcctcctttc-3’。

22、进一步地，所述双酶切后片段为

23、ggaagttctgttccaggggcccggatccgaaaacggttataaatttgtgtacagccagctgccg

24、ctgggtagcctggtgctggttaaactgcgcaattggccgtcatggccgggcattctgtgcccgg

25、atccgtttaaaggcaaatacgtgacctatgatcaggatggcaacgtcgaaaaatattacgtgga

26、atttctgggcgatccgcacagcaccgcatggatgagcgcggcgttcgtgggtcactttagcctg

27、accctggaagcggcggattgcaccaaaaaaaaacgctggtaccgcagcgcgctggaagaagcgt

28、atcagctgtatcgctgcagcgcggaacagcgcctggaagtgtgctgcctgagcggcagctaagaattcgagctccgtcgac。

29、进一步地，所述凝胶电泳的条件为：0.5～1.5％琼脂糖，25～35min；

30、所述双酶切的条件为35～39℃，16～24h；

31、所述连接的条件为15～17℃，4～6h；

32、所述菌落培养的条件为35～39℃，16～24h，210～230rpm。

33、进一步地，所述ni亲和层析包括8xhis亲和标签；

34、所述sthisfl_gst_precission3c酶包括gst标签。

35、进一步地，所述ni亲和层析和所述透析酶切的buffer体系中nacl的浓度为500～1000mm。

36、进一步地，所述裂解的条件为3～5℃，600～900bar；

37、所述裂解使用裂解液，所述裂解液包括500～1000mm的nacl、20～50mm的tris-hcl、20～60mm咪唑、0.5～1.0mm的pmsf、10～50μg/ml的dnasei和5～10％甘油。

38、上述技术方案设计mbp-zcwpw2融合蛋白，促进了zcwpw2蛋白结构域的正确折叠，并提高目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达量和稳定性；上述技术方案使用高盐体系，降低了mouse zcwpw2蛋白与其它蛋白的非特异性结合，并提高了zcwpw2的稳定性和溶解度，提升了mouse zcwpw2的产量和纯度；上述技术方案使用的precission3c蛋白酶可在低温情况下(4℃)对mbp-zcwpw2融合蛋白酶切，去除mbp；酶切后的zcwpw2能够长时间稳定存在，不从溶液中析出。