一种发根农杆菌介导的宁夏枸杞转LbbHLH36基因方法

本发明属于植物基因工程，更具体地说，涉及一种发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法。

背景技术：

1、枸杞属(lycium l.)植物为茄科(solanaceae)茄族(solaneae reichb.)枸杞亚族(lyciinae wettst.)植物。全球范围内枸杞属植物约80种，广泛分布在世界各地。枸杞在我国也有广泛的分布。1978年的《中国植物志》将枸杞属分为7种3变种，即枸杞(lyciumchinense mill)、宁夏枸杞(lycium barbarum l)、新疆枸杞(lycium dasystemumpojark)、黑果枸杞(lycium ruthenicum murr)、截萼枸杞(lycium truncatum y.c.wang)、柱筒枸杞(lycium cylindricum kuang et a.m.lu)、云南枸杞(lycium yunnanensekuanget a.m.lu)；变种北方枸杞(lycium chinense mill.var.potaninii(pojark)a.m.lu)、黄果枸杞(lycium barbarum l.var.auranticarpum k.f.ching)、红枝枸杞(lyciumdasystemum pojark.var.rubricaulium a.m.lu)。

2、从植被角度分析，宁夏枸杞属草原荒漠区分布种，常生于土层深厚的沟岸、山坡、田埂和宅旁，耐盐碱、沙荒和干旱，这为枸杞的健康生长提供了一个理想的生态环境。其土壤质量富含养分和保持适宜的水分供应，为枸杞植物提供了必要的生长资源。

3、宁夏枸杞遗传转化体系的建立不仅有利于深入研究其在不同非生物胁迫逆境中的功能，更有利于进一步扩大宁夏枸杞产量，提高质量以及品种改良，进而为我国枸杞产业的进一步发展提供理论依据。目前报道的枸杞转基因都是根癌农杆菌介导的遗传转化。尽管根癌农杆菌介导的枸杞遗传转化技术在一定程度上促进了枸杞基因功能研究的发展，但根癌农杆菌介导的转基因方法转化周期长、效率低以及操作繁琐等问题，难以建立高效的遗传转化体系。因此，探寻一种效率高，操作简单的遗传转化体系来提高宁夏枸杞遗传转化效率和质量尤为必要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法，用于建立高效的宁夏枸杞遗传转化体系。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法，包括：

4、1)将宁夏枸杞种子消毒后培养至萌发获得幼苗，将幼苗下胚轴处用无菌刀片进行划伤；

5、2)通过冻融法将携带目的基因的重组质粒转入发根农杆菌中，制备菌液；

6、3)将发根农杆菌甘油菌进行划平板培养，挑取单菌落进行pcr验证，将pcr验证阳性的单菌落用无菌枪头点到新的含50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l硫酸链霉素的lb固体培养基上于28℃生长24～36h备用；；

7、4)将宁夏枸杞幼苗下胚轴处用无菌刀片进行划伤，将切口处接种于活化后的发根农杆菌中进行侵染；

8、5)将侵染后的宁夏枸杞幼苗在16h/8h光周期下培养3周，培养温度23～25℃；

9、6)用手持式荧光观测仪进行观测，提取诱导出的有荧光的毛状根基因组dna并进行目的基因的扩增。

10、所述发根农杆菌为k599发根农杆菌或msu440发根农杆菌或c58c1发根农杆菌。

11、所述发根农杆菌为k599发根农杆菌。

12、所述k599发根农杆菌菌液的活化方法为通过冻融法将携带目的基因的重组质粒转入发根农杆菌k599中，挑取验证阳性的单克隆至含有50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l硫酸链霉素的lb液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养16-24h，得到活化后的发根农杆菌k599菌液。

13、所述目的基因为egfp基因、lbbhlh36基因。

14、所述egfp基因的重组质粒为35s::egfp。

15、所述lbbhlh36基因的重组质粒为pri101-lbbhlh36-egfp。

16、发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法，具体步骤包括：

17、1)将宁夏枸杞果实置于水中浸泡过夜，将种子取出后置于1.5ml离心管中，用70％乙醇浸泡消毒2min，倒掉酒精，用0.5％ naclo浸泡消毒15min，倒掉naclo，用无菌水洗3-5次；将消毒后的种子点播于含有ms固体培养基的组培瓶中，4℃春化48h，22℃暗培养48h；然后将组培瓶转移至培养室中继续进行培养至种子萌发；将组培瓶中萌发10d的宁夏枸杞幼苗转移到营养土中，随后盖上透明塑料盖置于光照培养箱中生长；

18、2)通过冻融法将带目的基因的重组质粒35s::egfp或pri101-lbbhlh36-egfp转入k599发根农杆菌或msu440发根农杆菌或c58c1发根农杆菌中，挑取验证阳性的单克隆至含有50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l硫酸链霉素的lb液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养16-24h，取摇好的菌液与50％的甘油等体积混匀，用液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱备用；将保存的发根农杆菌k599甘油菌在含有50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l硫酸链霉素的lb固体培养基上进行划平板，28℃倒置培养48h，挑取单菌落进行pcr验证，将pcr验证阳性的单菌落用无菌枪头点到新的含50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l硫酸链霉素的lb固体培养基上于28℃生长24～36h备用；

19、3)将转移到土培中2周的宁夏枸杞于下胚轴处用无菌刀片进行划伤，将切口处接种于在lb固体培养基中生长的k599或msu440或c58c1阳性菌落中，侵染完成后盖上塑料盖保湿并将侵染后的植株转移到培养箱中，培养温度为23～25℃，16h/8h光周期；

20、4)用luyor-3415g手持式荧光观测仪对转化植株的毛状根进行观测；

21、5)将诱导出的荧光毛状根在液氮中速冻并研磨成粉末，使用ctab法提取基因组dna进行pcr扩增检测，诱导获得的宁夏枸杞转基因荧光毛状根中rolb基因、neor基因、egfp基因、lbbhlh36基因均能扩增出条带。

22、发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法获得的宁夏枸杞转基因根系。

23、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

24、本发明公开的发根农杆菌介导的宁夏枸杞转lbbhlh36基因方法，将宁夏枸杞幼苗下胚轴处用无菌刀片进行划伤，将切口处接种于活化后的发根农杆菌k599菌液中，培养得到宁夏枸杞转基因植株；发根农杆菌k599菌液中携带目的基因的重组质粒：35s::egfp或pri101-lbbhlh36-egfp。

25、诱导获得的宁夏枸杞转基因荧光毛状根中rolb基因、neor基因、egfp基因、lbbhlh36基因均能扩增出条带，表明发根农杆菌诱导的转基因毛状根成功获得，说明用该体系将目的基因转入宁夏枸杞根系中是快速可行的。