产视黄醛的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用

本发明涉及基因工程，特别是产视黄醛的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用。

背景技术：

1、巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养酵母，具有很强的呼吸代谢能力，因此在简单培养基中生长到非常高的细胞密度，也可以很容易地从摇瓶扩大到大规模生物反应器。因此，巴斯德酵母的综合特性使该菌株在生产类胡萝卜素等化合物方面具有巨大的潜力。最近的研究已经证明，巴斯德氏菌适合于生产透明质酸、类胡萝卜素和倍半萜(+)-诺卡酮等天然产物。与其他微生物相比，巴斯德毕赤酵母安全可靠，可用于食品、医药等众多行业；菌株生长速度快，抗逆性强，培养简单，适合工业化；分子操作平台成熟且遗传工具完善，发展前景广阔。在巴斯德毕赤酵母中引入外源β母胡萝卜素合成模块和视黄醛合成模块能够使其异源合成视黄醛。现有技术已有对巴斯德毕赤酵母菌进行基因改造获得产视黄醛的重组巴斯德毕赤酵母。在引入产物合成模块后所得的视黄醛对细胞有一定毒害作用，视黄醛产量增加的同时带来的细胞伤害也抑制了产量的进一步增长，使得视黄醛产量无法进一步提高。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供产视黄醛的重组巴斯德毕赤酵母。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株产视黄醛的重组巴斯德毕赤酵母菌株，向巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)中导入香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶thmgr以及β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶bcmo的表达盒得到。

4、作为一种优选的实施方式，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母gs115菌株。

5、作为一种优选的实施方式，所述香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti的基因来源于解脂耶氏酵母；

6、所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶的基因来源于酿酒酵母。

7、所述β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶的基因来源于海洋细菌marine bacterium66a03。

8、作为一种优选的实施方式，所述香叶基香叶基二磷酸合酶crte的编码基因序列如seq idno：1所示；所述八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶的编码基因序列如seq idno：2所示；所述八氢番茄红素去饱和酶的编码基因序列如seq id no：3所示；所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶编码基因序列如seq id no：4所示；所述β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶的编码基因序列如seq id no：5所示。

9、作为一种优选的实施方式，所述表达盒的启动子为巴斯德毕赤酵母的pgpm1启动子、ppdc1启动子、pmdh3启动子、padh2启动子或pgap启动子；所述终止子为巴斯德毕赤酵母的sccyc1tt终止子、rpp1btt终止子、rps2tt终止子、rpl2att终止子或rpl25att终止子。

10、作为一种优选的实施方式，所述重组巴斯德毕赤酵母还表达1个标记基因；所述标记基因选自质粒bb3ak-af的硫酸卡那霉素编码基因表达盒。

11、本发明的第二目的在于提供上述重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，包括：将所述香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶thmgr以及β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶bcmo的表达盒通过质粒形式导入所述巴斯德毕赤酵母菌株，整合在巴斯德毕赤酵母菌株基因组上。

12、作为一种优选的实施方式，所述构建方法包括：将香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶thmgr以及β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶bcmo的基因片段通过goldengate方法插入质粒bb1-23中，得到质粒bb1-23-crte、bb1-23-crtyb、bb1-23-crti、bb1-23-thmgr以及bb1-23-blh；

13、将所述质粒bb1-23-crti与质粒bb1-12-pgpm1、质粒bb1-34-sccyc1tt通过goldengate方法插入质粒bb2-ab中，得到质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt；

14、将所述质粒bb1-23-crte与质粒bb1-12-ppdc1、质粒bb1-34-rpp1btt通过goldengate方法插入质粒bb2-bc中，得到质粒bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt；

15、将所述质粒bb1-23-crtyb与质粒bb1-12-pmdh3、质粒bb1-34-rps2tt通过goldengate方法插入质粒bb2-cd中，得到质粒bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt；

16、将所述质粒bb1-23-thmgr与质粒bb1-12-padh2、质粒bb1-34-rpl2att通过goldengate方法插入质粒bb2-de中，得到质粒bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att；

17、将所述质粒bb1-23-blh与质粒bb1-12-pgap、质粒bb1-34-rpl25att通过goldengate方法插入质粒bb2-ef中，得到质粒bb2-ef-pgap-blh-rpl25att；

18、将所述重组质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att和bb2-ef-pgap-blh-rpl25att通过goldengate方法插入质粒bb3ak-af中，得到质粒bb3ak-af-crtieybthmgrblh；

19、将所述重组质粒bb3ak-af-crtieybthmgrblh导入巴斯德毕赤酵母，获取重组巴斯德毕赤酵母菌株。

20、本发明的第三目的在于提供上述重组巴斯德毕赤酵母菌株在发酵生产视黄醛中的应用。

21、作为一种优选的实施方式，所述重组巴斯德毕赤酵母菌株在18～30℃下发酵生产视黄醛；

22、发酵碳源选自葡萄糖、果糖、甲醇、乙醇、甘油中的一种或几种。

23、发酵氮源选自酵母粉、蛋白胨、玉米浆干粉、尿素、(nh4)2so4、nh4cl中的一种或几种

24、本发明的重组巴斯德毕赤酵母能够表达香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶和β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶bcmo，构建方法高效、简单。实验证明该重组巴斯德毕赤酵母能够发酵生产视黄醛，实现了天然产物视黄醛在巴斯德毕赤酵母中的高效合成。

25、本发明在原始巴斯德毕赤酵母中引入视黄醛合成模块的同时，强化上游甲羟戊酸途径来增加视黄醛的前体物质，对高价值萜类产物的工业化以及商业化应用具有重大的现实意义和经济价值。