一种通过基因编辑ClCKI1创制二倍体无籽西瓜的方法

本发明涉及植物基因工程育种，更具体的说是涉及一种通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜的方法。

背景技术：

1、西瓜(citrullus lanatus)，其成熟果实中含有丰富的糖、有机酸、维生素和矿物质，具有重要的营养食用价值，是全世界普遍栽培、经济价值很高的重要园艺作物。无籽西瓜因其无籽食用方便、甜度高、营养品质丰富、抗病性强和耐贮存受到消费者和生产者的青睐。近年来无籽西瓜研究主要集中于二倍体和四倍体西瓜杂交得到三倍体无籽、激素无籽和染色体易位少籽。传统的三倍体无籽西瓜通过四倍体和二倍体杂交而来，育种过程中四倍体母本较难获得，三倍体种子形成困难、种量少种皮厚、种子发芽率低和成苗率低导致种子生产成本较高。激素无籽和染色体易位少籽育种过程手续繁杂，费时费工，坐果率低，果实无籽性和商品性差(郑晓鹰等，2005)。育种周期长和育种成本高极大地限制了无籽西瓜的推广与发展。近年来，无籽西瓜在分子生物学水平上的技术研究处于起始阶段，随着遗传工程在育种领域的应用，可对西瓜生殖发育基因进行修饰，使其双受精失败不能正常形成种子，从而使在二倍体水平上创制无籽西瓜成为可能。

2、被子植物的生活周期经历了从二倍体孢子体世代到单倍体配子体世代的交替过程，该过程是通过配子体发育，双受精形成合子，胚胎发育而实现的，雌配子体发育对于植物有性生殖与作物产量具有重要意义。细胞分裂素组氨酸蛋白激酶(cki1)是细胞分裂素信号的组成激活因子，是被子植物中心细胞的关键决定因素，是胚乳的前体，并在雌配子发育过程中起重要作用。cki1在胚囊发育的fg1(female gametophyte 1)时期至成熟胚囊期fg7时期稳定表达，高表达集中在在成熟胚囊期的中央细胞中，在卵细胞和助细胞中的表达较低。cki1的功能性状研究在西瓜中还未曾报道。

3、crispr/cas9介导的植物基因组编辑技术可以对作物优良性状进行定点修饰，从而实现作物的精准育种，提高育种效率。因此，提供一种通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜的方法，利用crispr/cas9对西瓜组氨酸激酶蛋白clcki1(cla97c02g040700)编辑创制二倍体水平无籽西瓜，缩短无籽西瓜育种周期，减少育种成本，加速育种进程。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种双靶位敲除载体，包括grna1和grna2，或grna3和grna4双靶点；

4、所述grna1、grna2、grna3、grna4序列如下：

5、grna1：5’-aattttgctaaacttctca-3’；seq id no.3；

6、grna2：5’-cattggtcagtagcaacac-3’；seq id no.4；

7、grna3：5’-ttcttcgaactcaaatcta-3’；seq id no.5；

8、grna4：5’-tccaccacgggaatatagt-3’；seq id no.6。

9、进一步，一种通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜的方法，具体步骤如下：

10、1)根据clcki1 cds序列设计所述的靶点grna1、grna2、grna3、grna4；

11、2)构建clcki1 crispr/cas9双靶位敲除载体；grna1和grna2，grna3和grna4分别组合双靶点；

12、(1)利用限制性内切酶bsai-hf对crispr/cas9载体pbse402进行酶切，回收酶切后的载体pbse402；

13、(2)以中间载体pcbc-dt1t2为模板，利用引物target1-1f/target1-2r和target1-3f/target1-4r分别进行pcr扩增，分别回收目的片段1和目的片段2；

14、(3)将步骤(1)酶切后的载体pbse402与步骤(2)回收的目的片段分别进行同源重组，转化dh5α感受态；

15、(4)将步骤(3)得到的菌落分别摇菌并抽提重组质粒，测序比对，将测序正确的重组质粒分别转化至农杆菌eha105感受态中；

16、(5)将步骤(4)得到的菌落进行pcr检测，验证正确后进行西瓜遗传转化；

17、3)西瓜遗传转化经过侵染、共培养、恢复培养、选择培养、芽伸长培养和生根培养阶段得到转基因植株；

18、4)将步骤3)获得的转基因植株进行基因编辑检测，将基因编辑植株移栽至试验田进行无籽表型观察。

19、进一步，所述clcki1 cds序列如seq id no.2所示。

20、进一步，所述引物target1-1f/target1-2r和target1-3f/target1-4r序列如下：

21、target1-1f：

22、5’-tcgaagtagtgattgtgagaagtttagcaaaattgttttagagctagaaatagc-3’；seq idno.7；

23、target1-2r：

24、5’-ttctagctctaaaacgtgttgctactgaccaatgcaatctcttagtcgactctac-3’；seq idno.8；

25、target1-3f：

26、5’-tcgaagtagtgattgttcttcgaactcaaatctagttttagagctagaaatagc-3’；seq idno.9；

27、target1-4r：

28、5’-ttctagctctaaaacactatattcccgtggtggacaatctcttagtcgactctac-3’；seq idno.10。

29、进一步，所述的双靶位敲除载体或所述的方法在无籽西瓜育种中的应用。

30、本发明西瓜遗传转化选用的材料为野生品种‘yl’。

31、所述基因编辑是通过crispr/cas9系统来实现的。clcki1突变体营养生长和雄配子不受影响，雌配子不育。本发明基因编辑方法，可以缩短无籽西瓜育种周期，节约育种成本，加速无籽西瓜的良种繁育进程，丰富无籽西瓜的种质资源。

32、本发明采用crispr/cas9技术，对西瓜clcki1基因靶向敲除，从而使其基因功能缺失，突变体表现为雌配子不育，受精失败，种子败育，只有少量白壳种子产生，在二倍体水平实现无籽西瓜。本发明通过crispr/cas9创制的二倍体无籽西瓜，有效缩短无籽西瓜的育种周期，为无籽西瓜在分子生物学水平上的研究提供了理论基础。

33、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜的方法，首次利用crispr/cas9技术，对西瓜clcki1基因进行靶向编辑，使其基因功能缺失，雌配子体不育，受精失败，只能形成少量白壳种子，从而创制二倍体无籽西瓜。通过本发明方法创制的二倍体无籽西瓜编辑植株与野生型材料相比，除了雌配子不育，雄配子和营养生长阶段无明显表型变化。该方法具有操作简单、效率高、成本低和周期短等优点。通过基因编辑clcki1创制二倍体无籽西瓜，缩短育种周期，节约育种成本，丰富无籽西瓜育种资源，为加速无籽西瓜的良种繁育具有重要意义。