双氮杂环类化合物、环状三甲川菁类化合物及其制备方法、成像剂与应用

本发明涉及一种双氮杂环类化合物、环状三甲川菁类化合物及其制备方法、成像剂与应用，尤其涉及一种用于制备荧光成像分子的双氮杂环类化合物以及具有荧光成像性能的环状三甲川菁类化合物及其制备方法、成像剂与应用。

背景技术：

1、菁染料是一类常见的荧光染料分子，具有摩尔消光系数高，荧光量子产率高，光谱范围可调等优点，其在分子荧光成像，化学与生物学等领域得到广泛研究与应用。目前已有的三甲川菁染料因其结构单一导致其光谱性能受限，进而影响其应用。

2、同时，关于环状三甲川菁染料的高效合成方法及其相关应用却鲜有报道。一方面三甲川菁染料的传统合成反应需要高温和强酸强碱的反应条件，对氧气敏感，进而易引起不必要的副反应，并且一些结构复杂的菁染料，如不对称菁染料往往需要分步合成，操作繁琐且难以控制；另一方面由于反应一般条件苛刻，不能有效地在生命体系中进行。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供一种作为荧光染料制备前体的双氮杂环类化合物，第二目的是提供一种具有荧光成像性能的环状三甲川菁类化合物，第三目的是提供一种所述荧光染料前体及其制得的荧光染料的制备方法，第四目的是提供一种由所述荧光染料制成的成像剂，第五目的是提供一种所述荧光染料及其成像剂的生物学应用。

2、技术方案：本发明所述的双氮杂环类化合物具有式i的结构，

3、

4、其中：

5、l1选自取代的或未取代的以下任一基团：c1～c16烷基、c1～c16烷氧基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基、c1～c16烷硫基、c1～c16烷氨基、c1～c16烷基的c1～c16羧酸酯基、c1～c16烷基取代的c1～c16酰胺基、c1～c16酰胺基、c1～c16烷基的碳酸酯基、c1～c16烷基的c1～c16磺酸酯基、6～18元芳酰基、苯基、萘基、蒽基、菲基、苊基或四氢萘基；所述的取代基选自1～3个以下任一的取代基：氢、c1～c16烷基、氰基、硝基、卤素、c1～c16卤代烷基、羟基、巯基、c1～c16烷氧基、c1～c16烷硫基、c1～c16烷氨基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基、羧基、醛基、c1～c16烷基的c1～c16羧酸酯基、c1～c16烷基取代的c1～c16酰胺基、c1～c16酰胺基、氨基、氨基甲酰基、磺酸基、氨基磺酰基、6～18元芳基取代的c1～c16烷基、6～18元芳基二取代的c1～c16烷基、6～18元芳基或het；

6、r1、r2选自氢、c1～c16烷基、氰基、硝基、卤素、c1～c16卤代烷基、羟基、巯基、c1～c16烷氧基、c1～c16烷硫基、c1～c16烷氨基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基、羧基、醛基、c1～c16烷基的c1～c16羧酸酯基、c1～c16烷基取代的c1～c16酰胺基、c1～c16酰胺基、氨基、氨基甲酰基、磺酸基、氨基磺酰基、6～18元芳基取代的c1～c16烷基、6～18元芳基二取代的c1～c16烷基、6～18元芳基或het；

7、x1、x2选自cr3r4、s、nr5、o或se；

8、r3、r4、r5选自取代的或未取代的以下任一基团：氢、c1～c16烷基、氰基、硝基、卤素、c1～c16卤代烷基、羟基、巯基、c1～c16烷氧基、羧基、醛基、c1～c16烷基的c1～c16羧酸酯基、c1～c16烷基取代的c1～c16酰胺基、c1～c16酰胺基、氨基、氨基甲酰基、磺酸基、氨基磺酰基、6～18元芳基取代的c1～c16烷基、苯基、萘基、苊基或四氢萘基；所述的取代基选自1～3个以下任一的取代基：氢、c1～c16烷基、氰基、硝基、卤素、c1～c16卤代烷基、羟基、巯基、c1～c16烷氧基、c1～c16烷硫基、c1～c16烷氨基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基、羧基、醛基、c1～c16烷基的c1～c16羧酸酯基、c1～c16烷基取代的c1～c16酰胺基、c1～c16酰胺基、氨基、氨基甲酰基、磺酸基、氨基磺酰基、6～18元芳基取代的c1～c16烷基、6～18元芳基二取代的c1～c16烷基、6～18元芳基或het；

9、z1、z2选自取代的或未取代的以下任一基团：苯基、萘基、苊基或四氢萘基，或者z1、z2不存在；所述的取代取选自1～3个以下任一的取代基：氢、c1～c16烷基、羟基、巯基、氰基、硝基、羧基、醛基、卤素、c1～c16卤代烷基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基、氨基、氨基甲酰基、磺酸基、氨基磺酰基、6～18元芳基取代的c1～c16烷基、6～18元芳基二取代的c1～c16烷基、芳基或het；

10、所述的het选自取代的或未取代的以下任一基团：吡咯基、呋喃基、吡唑基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、嘧啶基、吡嗪基、吡啶基、四氢吡咯基、六氢吡嗪基、哌啶基或吗啉基、吡喃基、噻喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并吡唑基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并嘧啶基、苯并吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹啉酮基或嘌呤基；所述的取代基选自1～3个以下任一的取代基：c1～c16烷基、羟基、巯基、氨基、氰基、硝基、羧基、醛基、卤素、c1～c16卤代烷基、c1～c16烷氧基、c1～c16烷硫基或c1～c16烷氨基；

11、优选，上述l1、x1、x2、z1、z2、r1、r2的定义中的c1～c16链为直链碳链。

12、优选，所述结构中：

13、l1选自c1～c16烷基、c1～c16烷氧基取代的c1～c16烷基或苯基；

14、r1、r2选自氢或c1～c16烷氧基；

15、x1、x2选自cr3r4；

16、r3、r4选自c1～c16烷基；

17、z1、z2选自苯基或不存在。

18、优选，所述结构中：l1选自-(ch2)4-、-(ch2)10-、-(ch2)16-、-ch2-o-(ch2)2-o-ch2-或1,4-苯基；

19、x1、x2选自cr3r4；

20、r3、r4选自c1～c4烷基，更优选为甲基、乙基。

21、优选，本发明所述的双氮杂环类化合物选自以下任一的化合物：

22、

23、

24、本发明所述的环状三甲川菁类化合物具有式ii-1或ii-2的结构，

25、

26、其中：

27、y选自卤素、四氟硼酸根、四苯硼酸根、氯酸根、高氯酸根、碘酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、甲酸根、乙酸根、三氟乙酸根、六氟磷酸根、双(三氟甲基磺酰)亚胺、双(全氟丁基磺酰基)亚胺、甲磺酸根、苯磺酸根、对甲苯磺酸根、草酸根、水杨酸根、丙酮酸、苹果酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、酒石酸根；

28、l1、x1、x2、z1、z2、r1、r2的定义如前所述。

29、优选，所述化合物i、ii-1、ii-2结构中：

30、选自

31、优选，本发明所述的环状三甲川菁类化合物选自以下任一的化合物：

32、

33、

34、本发明所述的环状三甲川菁类化合物的制备方法包含以下步骤：

35、(1)化合物iii经解盐反应得到化合物i；

36、

37、(2)化合物i与等摩尔的甲醛反应得到化合物ii-1或ii-2；

38、

39、其中，l1、x1、x2、z1、z2、y、r1、r2定义如前所述。

40、具体地，当z1、z2为苯基，x1、x2为c(ch3)2，l1为(ch2)4，r1、r2为氢时，本发明所述的双氮杂环类化合物的制备方法包括以下步骤：

41、(1)将2,3,3-三甲基-3h-苯并吲哚和1,6-二碘己烷溶于无水二氧六环中，在避光无氧条件下于120℃中回流加热，反应结束后旋干溶剂。粗产物经过硅胶柱层析纯化。其中，2,3,3-三甲基-3h-苯并吲哚和1,6-二碘己烷的摩尔比为1:6。

42、(2)将1,1’-(己烷-1,6-二基)双(2,3,3-三甲基-3h-苯并吲哚)和200-300目中性氧化铝在二氯甲烷中进行混合，在避光条件下通过氧化铝柱层析进行分离纯化，即得到1,1’-(己烷-1,6-二基)双(2-亚甲基-3,3-二甲基-3h-苯并吲哚)。化学反应式如下：

43、

44、其中，所述柱层析洗脱剂比例为二氯甲烷:甲醇＝100:5。上述柱层析过程中产生的深色物质可通过100-200目氧化铝快速柱层析进行除去，所用柱层析洗脱剂为石油醚。得到的双氮杂环类化合物可在正戊烷-二氯甲烷混合溶剂中通过低温重结晶再次进行纯化。

45、上述双氮杂环类化合物可进一步用于细胞内环状三甲川菁染料的原位合成。

46、具体地，当环状三甲川菁染料为[1+1]结构，z1、z2为苯基，x1、x2为c(ch3)2，l1为(ch2)4，r1、r2为氢时，本发明所述的环状三甲川菁染料的制备方法包括以下步骤：

47、将1,1’-(己烷-1,6-二基)双(2-亚甲基-3,3-二甲基-3h-苯并吲哚)，甲醛水溶液和氯化血红素在dmf中混合，在37℃下进行加热得到[1+1]对称结构的环状三甲川菁染料。化学反应式如下：

48、

49、当所述环状结构为[2+2]，z1、z2为苯基，x1、x2为c(ch3)2，l1为(ch2)4，r1、r2为氢时，本发明所述的环状三甲川菁染料的制备方法包括以下步骤：

50、将1,1’-(己烷-1,6-二基)双(2-亚甲基-3,3-二甲基-3h-苯并吲哚)，甲醛水溶液和三氯化铁在dmf中混合，在37℃下进行加热得到[2+2]对称结构的环状三甲川菁染料。化学反应式如下：

51、

52、其中，反应为常氧条件，双吲哚分子:甲醛:氯化血红素/fecl3＝1:5:1(摩尔比)，反应溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、水、1,4-二氧六环、乙酸、二甲基亚砜、乙腈或氯仿。

53、本发明开创性地利用过渡金属铁(氯化血红素)实现了吲哚分子和甲醛的快速点击连接反应，对多种[1+1]和[2+2]环状三甲川菁染料进行可控合成，环状菁染料类点击反应(ccclick)的反应条件温和，分子结构设计简单，反应经济且高效。设计的合成方法可用于细胞内环状三甲川菁染料的原位合成，并用于线粒体细胞器的荧光成像。

54、本发明所述的成像剂由本发明所述的环状三甲川菁类化合物制成。

55、本发明所述的环状三甲川菁类化合物或者由其制成的成像剂应用在细胞内线粒体细胞器的荧光成像中。

56、优选，所述荧光成像的红光激发波长为543nm，绿光激发波长为488nm。

57、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

58、1、本发明设计的双氮杂环类化合物与细胞共孵育，能够实现胞内原位合成环状三甲川菁染料，用于细胞内荧光成像，具体定位于细胞中的线粒体，实现线粒体细胞器的荧光成像；

59、2、本发明设计的制备方法中，双氮杂环类化合物在过渡金属铁的催化氧化下和甲醛分子进行快速地ccclick反应，还可以通过生物分子氯化血红素介导，可用于多种结构环状三甲川菁染料的精准合成；ccclick反应条件温和，反应速率快，前体分子合成简单，并且副产物作仅为水；通过调整反应参数和双氮杂环分子内的链刚性，能够可控生成[1+1]和[2+2]环状三甲川菁染料。