一种细胞灌流培养体系维持稳态的方法与流程

本技术涉及细胞培养，尤其涉及一种细胞灌流培养体系维持稳态的方法。

背景技术：

1、自1994年第一个采用灌流工艺生产的abciximab被美国fda获批后，灌流工艺开始正式被生物医药行业逐步认可，产品类型涵盖了抗体、血液因子、病毒颗粒等不同类型的生物制品。相较于传统的流加补料和分批培养，灌流培养能够将收获的目标产物及时分离储存，减少目标产物在胞外的氧化、酶降解等再修饰；生物反应器的规模可以缩小至传统商业化规模的1/10左右，以减少早期设备成本投入。

2、中国仓鼠卵巢(cho)细胞灌流培养是生产蛋白类药物常用工艺手段。在该工艺中，维持高细胞密度及长时间细胞活率、密度极为关键。因此，在工艺早期开发阶段的重点工作内容除了需要开发一种维持长时间细胞活率、密度的灌流培养基，还需要开发一种合适的工艺控制条件平台。

3、摇管由于通量高、操作简单、气体传质效果好等优势，常被用做灌流前期工艺开发平台。采用摇管进行模拟灌流可以初步反应细胞在不同密度情况下细胞生长动力学规律，以及产物比生长速率情况。但在摇管工艺中，灌流培养基换液通常是每天通过离心一次性更换的方式，然而灌流培养基由于营养丰富，渗透压也非常高，通常会给细胞生长带来不利影响，因此稳定控制细胞密度在摇管工艺中至关重要。

4、在灌流工艺中，经常采用的策略是进行定期的细胞放流(cell bleeding)来控制细胞密度。常见的摇管中控制细胞密度方法为每天一次性bleeding，来控制设定细胞密度上限或下限。然而，这种控制方法容易使得稳态期细胞密度及产量波动大，细胞长期活率、密度难以控制，达不到理想状态的稳定细胞状态，而且还无法做到高密度、高比生长速率情况下稳态期细胞密度精确调控，进而导致摇管中评估的结果难以在反应器中进行重现。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种细胞灌流培养体系维持稳态的方法，通过采用两步降温的手段使得细胞由生长期转入稳态期；同时针对高细胞密度的条件，依据细胞一级动力学倍增规律，按照相同的放流速率进行放流，进而维持细胞的稳态生长。

2、为实现以上目的，本技术的技术方案如下：

3、第一方面，本技术提供一种细胞灌流培养体系维持稳态的方法，包括：

4、将细胞置于生物反应器中，在t0温度下进行第一培养；

5、待所述生物反应器中的活细胞密度达到第一目标值时，将所述t0温度降低至t1温度，采用灌流培养基进行第二培养，维持4-5天后，再将所述t1温度升高至t2温度，继续进行第三培养，所述第二培养和所述第三培养不进行放流；

6、或者，待所述生物反应器中的活细胞密度达到第二目标值时，将所述t0温度降低至t2温度，采用灌流培养基进行第四培养，维持1-2天后，所述第四培养开始进行放流；

7、其中，t0＞t2＞t1。

8、优选地，所述t0的温度为36℃-37℃，所述t2的温度为33℃-34℃，所述t1的温度为30℃-32℃。

9、优选地，所述第一目标值为50×106cells/ml-75×106cells/ml；

10、所述第二目标值为30×106cells/ml-50×106cells/ml。

11、优选地，所述第一培养包括：

12、将所述细胞接种于所述生物反应器中，在所述t0温度下进行复苏并采用基础培养基进行扩增处理；

13、待所述扩增处理后的活细胞密度达到10×106cells/ml-20×106cells/ml时，采用所述灌流培养基、每天以固定灌流速率进行灌流培养，直至所述生物反应器中的活细胞密度达到所述第一目标值；

14、所述固定灌流速率为0.5vvd-1.5vvd。

15、进一步优选地，所述生物反应器为摇管时，将所述细胞接种至所述摇管中，将所述摇管放置在所述t0温度下、相对湿度为85％-95％，co2浓度为4％-6％的环境中，并将所述摇管倾斜15°-20°，在150rpm-180rpm的转速下，进行所述扩增处理。

16、优选地，所述第二培养和所述第三培养各自独立地包括：采用所述灌流培养基，每天以固定细胞比灌流速率进行灌流；

17、和/或，所述第四培养包括：采用所述灌流培养基，每天以固定细胞比灌流速率进行灌流，维持1-2天后，每天同时还以固定放流速率δivcc进行所述放流。

18、进一步优选地，所述固定细胞比灌流速率为20pl/(cells·d)-60pl/(cells·d)；

19、所述固定放流速率δivcc为40×106cells/ml·day-80×106cells/ml·day。

20、优选地，所述细胞由以下各者所构成的群组中选出：

21、cho、cho-k1、cho-s、dxb-11、dg-44、bhk细胞系。

22、优选地，所述细胞选自cho-k1细胞系时，包括：

23、将所述细胞接种于摇管中在36.5℃的温度下进行复苏并采用基础培养基进行扩增处理，待摇管中的活细胞密度达到10×106cells/ml之后，继续在36.5℃下，采用灌流培养基、每天按照1vvd的灌流速率进行灌流处理，待所述摇管中的活细胞密度达到50×106cells/ml之后，将温度降低至31℃，采用所述灌流培养基、每天以固定细胞比灌流速率50pl/(cells·d)进行灌流处理，维持4天之后，再将温度升高至33℃，每天继续以所述固定细胞比灌流速率进行灌流处理。

24、优选地，所述细胞选自cho-k1细胞系时，包括：

25、将所述细胞接种于摇管中在36.5℃的温度下进行复苏并采用基础培养基进行扩增处理，待摇管中的活细胞密度达到10×106cells/ml之后，继续在36.5℃下，采用灌流培养基、每天按照1vvd的灌流速率进行灌流处理，待所述摇管中的活细胞密度达到30×106cells/ml之后，将温度降低至33℃，采用所述灌流培养基、每天以固定细胞比灌流速率50pl/(cells·d)进行灌流处理，维持2天之后，同时开始进行放流，每天的固定放流速率δivcc为70×106cells/ml·day。

26、本技术的有益效果：

27、对于传统的一步降温法，细胞在降温后往往也会处于较快生长状态，使得细胞的早期密度往往大于目标细胞密度，后续只能通过放流的方式来控制细胞密度达到稳定状态，这会导致培养液的浪费，且营养成分的浓度也随细胞密度的波动而波动，无法达到接近理论的稳态浓度。本技术采用两步降温的方式，将细胞在相当于低温的状态下维持一段时间的灌流培养后，细胞会由生长转为稳态阶段，再将温度升高，加快细胞的代谢，从而不影响细胞分裂周期，同时又能保持细胞高分泌状态，使得细胞周期维持在g1/s期，即细胞比生长速率稳定维持在较低水平。

28、或者，本技术在细胞生长阶段，利用细胞生长曲线遵循一级动力学生长曲线，即等比增加，进而想到将高密度下的细胞按照相同的放流速率δivcc进行放流，进而维持细胞的长时间稳态生长规律，平稳维持稳态期的细胞密度和产物产量，延长灌流稳态的维持时间。