用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合及试剂盒

本发明涉及病毒检测领域，特别涉及用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、新冠病毒不断演化，并在关键位置特别是表面刺突蛋白(spike protein)上发生突变，感染性等指标有所提升。目前，对于新冠病毒众多突变株的高效、准确、简便的检测方法，需求仍较巨大而迫切。

2、环介导等温扩增技术(lamp)是一种由日本学者notomi等创建的等温核酸扩增技术。基本原理是针对靶标基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型rna聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，通过折叠形成哑铃型的茎环结构，从而以自身为模板无限延伸，具有扩增效率高、特异性灵敏性兼优、操作简单且成本低等优点。分子信标探针(mbp)是由茎部和环状结构组成发夹结构的双标记单链寡核苷酸探针，可利用mbp及荧光检测设备，特异性检测体系中是否含有靶标rna序列。

3、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)是世界卫生组织(who)推荐的针对sars-cov-2的常规确认试验方法，目前已有利用rt-qpcr和探针检测新冠病毒突变株的报道。

4、数字微流控芯片技术，基于介电润湿原理，通过微控制器的接口输出相应的控制电压，来激活相应的电极或撤销某些电极上的电压，使实验液滴按照设计好的移动路线完成实验流程，具有试剂用量少、反应速度快、可实现自动化等优点，在生化分析与医学检验等领域有着广阔的发展前景。

5、因此，亟需获得一种快速检测新冠位点突变位点的方法，可以对于新冠病毒众多突变株实现高效、准确、简便的检测。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合。

2、本发明的另一目的在于提供检测新冠病毒突变株的产品。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种引物探针组合1，包括以下引物和探针：

5、引物k417t-f3：gtcctatataattccgcatc；

6、引物k417t-b3：gaattccaagctataacgc；

7、引物k417t-fip：

8、ctgcatagacattagtaaagcagag-ttccacttttaagtgttatggagtgtctcc；

9、引物k417t-bip：

10、gaggtgatgaagtcagacaaatcgct-gcctgtaaaatcatctgg；和

11、探针k417t-p：fam-ataaactggaaagattgct-bhq1。

12、一种引物探针组合2，包括以下引物和探针：

13、引物l452r-f3：attagaggtgatgaagtcag；

14、引物l452r-b3：cggcctgatagatttcagtt；

15、引物l452r-fip：

16、cgcagcctgtaaaatcatctggtaatt-acaaatcgctccagggcaaactg；

17、引物l452r-bip：

18、atcttgattctaaggttggtgg-ggtttgagattagacttcct；和

19、探针l452r-p：fam-ataattacctgtatagattgt-bhq1。

20、一种引物探针组合3，包括以下引物和探针：

21、引物e484q-f3：ctaaggttggtggta；

22、引物e484q-b3：gttggtaaccaacac；

23、引物e484q-fip：

24、ggcctgatagatttcagttgaa-tatagattgtttaggaagtctaatc；

25、引物e484q-bip：ggtagcacaccttgtaatg-cattagtgggttggaaacc；和

26、探针e484q-p：fam-ataatggtgttgaaggttttt-bhq1。

27、一种引物探针组合4，包括以下引物和探针：

28、引物d614g-f3：ctgatgctgtccgtgatc；

29、引物d614g-b3：tgtagaataaacacgccaag；

30、引物d614g-fip：

31、ctggtgttataacactgacaccac-cacagacacttgagattcttgac；

32、引物d614g-bip：

33、aatacttctaaccaggttgctgttc-gagtaagttgatctgcatgaat；和

34、探针d614g-p：fam-attatcagatgttaactgct-bhq1。

35、一种引物探针组合5，包括以下引物和探针：

36、引物p681r-f3：tcaacaactcatatgagtgtg；

37、引物p681r-b3：ctggtagaatttctgtggtaac；

38、引物p681r-fip：ctagctacactacgtgcccg-catacccattggtgcagg；

39、引物p681r-bip：

40、tccatcattgcctacactatgtcac-agtaaaatttgtgggtatggc；和

41、探针p681r-p：fam-atagactaattctcatcggct-bhq1。

42、一种用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合，包括上述引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3、引物探针组合4和引物探针组合5中的至少一种。

43、进一步地，所述用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3、引物探针组合4和引物探针组合5。

44、进一步地，引物探针组合1用于检测突变位点417是否发生突变。

45、进一步地，引物探针组合2用于检测突变位点452是否发生突变。

46、进一步地，引物探针组合3用于检测突变位点484是否发生突变。

47、进一步地，引物探针组合4用于检测突变位点614是否发生突变。

48、进一步地，引物探针组合5用于检测突变位点681是否发生突变。

49、上述用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合在制备检测新冠病毒突变株的产品中的应用。

50、进一步地，所述的新冠病毒突变株包括阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)和德尔塔(delta)中的至少一种。

51、进一步地，所述的新冠病毒突变株的产品包括试剂盒和数字微流控芯片中的至少一种。

52、一种检测新冠病毒突变株的试剂盒或数字微流控芯片，包括上述用于检测新冠病毒突变株的引物探针组合。

53、一个新冠病毒突变株的检测系统，包括试剂与样品的分流单元、lamp反应单元、fam荧光通道检测单元、荧光与时间记录单元、荧光与温度记录单元、fam荧光通道检测判断单元、链解温度(tm)值判断单元和突变株判断单元。

54、进一步地，所述的试剂与样品的分流单元用于分样并将样品分别运输到检测不同位点的lamp单元；以及将对应位点的lamp反应体系的试剂运输到对应的lamp单元；所述的lamp反应体系含有用于检测不同位点的上述引物探针组合。

55、进一步地，所述的lamp反应单元用于进行lamp反应。

56、进一步地，所述的fam荧光通道检测单元用于检测fam荧光通道信号。

57、进一步地，所述的荧光与时间记录单元用于记录lamp反应期间荧光强度和时间的关系。

58、进一步地，所述的荧光与温度记录单元用于记录lamp反应后，在95℃维持1min让扩增产物充分变性为单链，再降至30℃并维持1min，使探针和产物环区充分退火结合，随后按0.5℃的梯度，逐步提升温度至75℃，每0.5℃记录荧光强度和温度的关系。

59、进一步地，所述的fam荧光通道检测判断单元用于判断荧光与时间记录单元记录的lamp反应期间荧光强度和时间的关系中是否出现扩增曲线，如是，则为新冠病毒阳性，如否，则为新冠病毒阴性。

60、进一步地，所述的链解温度值判断单元用于判断荧光与温度记录单元记录的荧光强度和温度的关系中链解温度是否小于等于阈值；如是，则该位点发生了突变。更进一步地，所述的阈值为：417位点47℃、452位点46℃、484位点54℃、614位点45℃和681位点47℃。

61、进一步地，所述的突变株判断单元用于根据链解温度值判断单元得到的位点突变结果和fam荧光通道检测判断单元的新冠病毒阳性阴性结果判断是否为新冠病毒突变株以及是否为阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)或德尔塔(delta)。

62、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

63、本发明通过lamp反应，以及设计的引物实现了新冠病毒突变株的快速检测。该方法可以结合数字微流控芯片技术，可简单灵活地实现高效的多液滴调度，并具有较高的可重构性和容差能力可以实现2小时内完成新冠病毒突变株的快速检测。同时相对测序来说，操作更为简易且成本更低。