基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品与流程

本发明属于干细胞，具体涉及基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品。

背景技术：

1、干细胞是未成熟细胞，其未充分分化，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞治疗已在糖尿病、帕金森综合征、红斑狼疮、白血病等多种疾病中进行了相应治疗尝试。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，ipsc）的制备技术及其应用，将干细胞治疗带入了一个全新时代。随着分子生物学技术，特别是基因编辑技术的不断发展，基因修饰在干细胞治疗中发挥着越来越重要的作用。

2、干细胞治疗作为一种再生医学技术，旨在用具有特定功能的细胞替代功能异常细胞，恢复相应细胞功能，改善机体健康状态。目前有多种干细胞用于临床， 其中，hsc移植已改善多种免疫系统和血液系统疾病的预后，如先天性免疫缺陷、多发性骨髓瘤、地中海贫血等。研究数据表明，异体hsc的植入可将r/raml（idh1/idh2突变的急性髓系白血病）患者的4年生存率提高至20%~35%。此外，msc因具有一定的免疫调节功能，被用于治疗免疫性疾病，如移植物抗宿主病等，取得了一定疗效。现有技术中已经公开了用于治疗腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷病（ada-scid）的自体hsc药物strimvelis及用于治疗阿尔茨海默病的自体msc药物astrostem。

3、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，msc）是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像apsc多能细胞。在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，msc是一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，msc迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。msc易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，msc是一种实用的组织修复种子细胞。

4、il-17为宿主保护粘膜感染的关键细胞因子，也是多种自身免疫和炎症性疾病的主要致病细胞因子和药物靶标。il-17家族包括六个成员：il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e和il-17f，各成员皆通过il-17受体（il-17ra至il-17re）介导其生物学功能。其中研究最多的il-17家族成员是il-17a，其通过与il-17ra和il-17rc结合来促进其生物活性。现有技术已经公开了il-17a在人类疾病中的病理作用的研究最终导致了针对il-17a（il-17a和il-17f、il-17ra或il-23）的单克隆抗体（mab）的开发。

5、研究il-17与干细胞的作用方式的现有技术如公开号为cn105079792a的中国专利申请，其公开了il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。具体地本发明提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂用于制备制剂或试剂盒的用途，用于提高间充质干细胞的免疫抑制功能；上调间充质干细胞中免疫抑制因子的表达；增强免疫抑制因子的mrna的稳定性；降低rna结合蛋白auf1的表达水平；抑制t细胞的增殖；治疗肝炎或肝损伤。

6、但现有技术中未有公开il-17相关抗体对干细胞的修饰，特别是il-17a特异性串联抗体在干细胞修饰中的作用。

7、本发明人致力于抗il-17a抗体开发，为便于审查，现对研发项目的技术背景进行简要介绍：

8、发明人基于筛选出的9个单域抗体（已另案申请），进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合（已另案申请）。

9、本发明在上述技术方案的基础上，继续进行技术开发，研发了单域抗体组合基因修饰干细胞技术，基于专利法单一性的相关规定，对多个不同的基因修饰干细胞分别请求保护，本案系基因修饰干细胞技术之一所进行的发明专利申请。

10、为便于理解本发明，可选地参阅本项目其他专利申请文件。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种修饰干细胞，基于免疫羊驼进行筛选，得到了多种具有il-17a特异性结合能力的纳米抗体，并选择了其中的两种进行串联，以实现干细胞修饰制备本发明目的的基因修饰干细胞。

2、本发明的干细胞，表达和/或分泌：

3、（1）第一抗体，所述的第一抗体包含特异性识别il-17a的单域抗体；和

4、（2）第二抗体，所述的第二抗体包含特异性识别il-17a的单域抗体；

5、所述的第一抗体和第二抗体的氨基酸序列不同。

6、所述的第一抗体包含序列如seq id no: 1-3所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和/或；与seq id no: 1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

7、seq id no: 1：gekldyfa；

8、seq id no: 2：vtssgsst；

9、seq id no: 3：astillcsdyisafgt。

10、所述的第二抗体包含序列如seq id no: 4-6所示的hcdr4、hcdr5、hcdr6；和/或；与seq id no: 4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

11、seq id no: 4：gfsihiya；

12、seq id no: 5：itrggvt；

13、seq id no: 6：naggtnggy。

14、本领域技术人员知晓，cdr区是抗体特异性识别抗原的区域，具到主要的结合活性，因此，本领域技术人员根据本发明记载的cdr区，理论上可以设计出多种抗体或融合蛋白进行应用。如采用纳米抗体的形式。

15、可选择地，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接，作为优选可以通过连接子连接。

16、优选地，所述的第一抗体和第二抗体通过连接子连接，所述的连接子为（ggggs）n，所述的n为≥1的整数，进一步优选为3。

17、优选地，所述干细胞包含、表达和/或分泌：

18、（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的结构包含：

19、fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4；

20、（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的结构包含：

21、fr5-hcdr4-fr6-hcdr5-fr7-hcdr6-fr8；

22、hcdr1-6选自seq id no: 1-6所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 1-6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

23、fr1-8选自seq id no: 7-14所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列。

24、seq id no:7：qvqlvesggglvqpggslrlscaas；

25、seq id no:8：igwfrqapgkerevvsc；

26、seq id no:9：nylssvkdrftisidnakntvylqmnslkpedtaiyyc；

27、seq id no:10：wgqgtqvtvas；

28、seq id no:11：evqlvesggglvqpggslrlscaas；

29、seq id no:12：mgwyrqapgkqrelvat；

30、seq id no:13：nnadsvkgrftisrdnakntaylqmnslkpedtavyyc；

31、seq id no:14：wgqgtqvtvss。

32、本发明中，所述氨基酸差异可以通过氨基酸的添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式实现。

33、在一些实施方案中，所述氨基酸的取代为保守取代，这种保守性取代优选地是以下组（a）到（e）中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代：（a）小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；（b）极性、带负电的残基及其（不带电的）酰胺：asp、asn、glu和gln；（c）极性、带正电的残基：his、arg和lys；（d）大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；以及（e）芳香族残基：phe、tyr和trp。

34、在一些优选的实施方案中，保守性取代如下：ala到gly或到ser；arg到lys；asn到gln或到his；asp到glu；cys到ser；gln到asn；glu到asp；gly到ala或到pro；his到asn或到gln；ile到leu或到val；leu到ile或到val；lys到arg、到gln或到glu；met到leu、到tyr或到ile；phe到met、到leu或到tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp；和/或phe到val、到ile或到leu。

35、进一步优选地，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白；

36、所述的融合蛋白包含结构为fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4-linker-fr5-hcdr4-fr6-hcdr5-fr7-hcdr6-fr8的氨基酸序列；

37、hcdr1-6选自：seq id no: 1-6所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 1-6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

38、fr1-8选自：seq id no: 7-14所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

39、linker选自：seq id no: 15所示的氨基酸序列。

40、seq id no: 15：ggggsggggsggggs。

41、更进一步优选，所述的干细胞包含、表达和/或分泌：

42、（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的序列包含如seq id no: 16所示的氨基酸序列；

43、（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的序列包含如seq id no: 17所示的氨基酸序列。

44、seq id no:16：

45、qvqlvesggglvqpggslrlscaasgekldyfaigwfrqapgkerevvscvtssgsstnylssvkdrftisidnakntvylqmnslkpedtaiyycastillcsdyisafgtwgqgtqvtvas。

46、seq id no:17：

47、evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsihiyamgwyrqapgkqrelvatitrggvtnnadsvkgrftisrdnakntaylqmnslkpedtavyycnaggtnggywgqgtqvtvss。

48、在一些具体实施例中作为示例所呈现，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白：

49、所述的融合蛋白的序列包含：seq id no:16-seq id no:15-seq id no:17-seqid no: 26所表示的氨基酸序列。

50、seq id no: 26：

51、apeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。

52、本领域技术人员可以理解，基于以上，本发明提供一种干细胞，所述的干细胞包含：

53、（1）第一核酸分子；和；（2）第二核酸分子；

54、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 1-3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

55、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 4-6所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

56、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 7-10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

57、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 11-14所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

58、优选地，所述的第一核酸分子和第二核酸分子之间由编码包含seq id no: 15所示的氨基酸序列的核苷酸序列连接。

59、进一步优选地，所述的干细胞包含：

60、（1）第一核酸分子；和；（2）第二核酸分子；

61、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 16所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

62、所述的第一核酸分子编码包含seq id no: 17所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

63、在一些具体的实施例中，作为示例所述的干细胞包含：编码seq id no:16-seq idno:15-seq id no:17-seq id no: 26所表示的氨基酸序列的核苷酸序列。

64、事实上，如本领域技术人员所公知，由于密码子简并性问题，在明确氨基酸序列的情况下，其对应的核酸序列是有无数可能性的，上述优选的核酸序列仅作为一个较优的示例，而非唯一可能性。

65、根据本领域已经公开的技术，所述的干细胞还可以包含、表达和/或分泌能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

66、或者，所述的干细胞包含编码能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段的核苷酸序列。

67、在一些优选的实施方案中，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白fc结构域、血清白蛋白（例如，人血清白蛋白（hsa））、白蛋白结合多肽（例如has结合多肽）、前白蛋白（也称为转甲状腺素）、羧基末端肽（例如，人绒毛膜促性腺激素β亚基（ctp））、弹性蛋白样多肽（elp）、his标签（优选6×his）、gst（谷胱甘肽巯基转移酶）标签、mbp（麦芽糖结合蛋白）标签、flag标签、sumo（泛素样修饰蛋白）标签等中的至少一种。

68、较佳地，所述生物活性蛋白或其功能片段为人免疫球蛋白fc结构域，优选人igg的fc结构域，例如人igg1、igg2、igg3、igg4的fc结构域，更优选人igg1的fc结构域。

69、可在本文中所提供抗体的fc区或fc结构域中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生fc区变体。fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰（例如置换、缺失和插入）的人fc区序列（例如人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区）。

70、在一些实施方案中，前述任一核酸分子独立于所述经修饰的干细胞的基因组、或整合于所述经修饰的干细胞的基因组。

71、在一些实施方案中，前述任一核酸分子可操作地连接至启动子，例如组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。

72、以上所述干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞等；

73、本发明中，所述的干细胞的类型按分化发育潜能区分可以包括：

74、全能干细胞：可以分化形成完整的个体，如胚胎干细胞（embryonic stem cell，es细胞）；多能干细胞：可以分化形成多种细胞组织器官，如造血干细胞、生殖干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞等；单能干细胞：指具有向一种或两种相关的细胞类型分化的潜能，如肌肉中的成肌细胞、上皮组织基底层的干细胞。

75、本发明中，所述的干细胞的类型按干细胞的发育阶段区分可以包括：

76、胚胎干细胞：高度未分化细胞，具有发育的全能型，能分化出成体的所有组织器官；成体干细胞：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

77、所述的成体干细胞包括但不限于：

78、造血干细胞：研究历史最长最深入的一类成体干细胞，具备分化为血液系统各种细胞的潜能，在疾病治疗、抗衰老保健等领域具有极大的应用潜能；生殖干细胞：具备分化为生殖细胞和性腺各种支持细胞的潜能，使成体得以发挥生育功能，并可以延缓性腺的衰老；间充质干细胞：具备分化为机体骨、软骨和各种器官细胞的潜能，还具备特有的免疫调节功能；神经干细胞：具备分化为神经系统各种细胞的潜能；视网膜干细胞：具备分化为视网膜各种细胞的潜能；心脏干细胞：具备分化为心脏各种细胞的潜能；肝脏干细胞：具备分化为肝脏各种细胞的潜能；胰腺干细胞：具备分化为胰腺各种细胞的潜能，在特定条件下，可以分化为胰岛细胞；肺脏干细胞：具备分化为肺脏各种细胞的潜能；肾脏干细胞：具备分化为肾脏各种细胞的潜能。

79、作为优选，所述的干细胞为间充质干细胞。

80、所述干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

81、根据以上，所述的干细胞分泌抗白细胞介素抗体。

82、优选地，所述的干细胞分泌抗白细胞介素17抗体。

83、进一步优选地，所述的干细胞分泌抗il-17a抗体。

84、基于以上干细胞，本发明还提供了：

85、一种细胞培养物，所述细胞培养物经根据前述的干细胞经培养获得。

86、一种提取物，所述提取物经前述的细胞培养物提取获得。

87、一种药物组合物，其包含前述的干细胞、细胞培养物或提取物；任选地，所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。

88、在一些实施方案中，所述辅料选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。

89、一种试剂盒，其包括前述的干细胞、细胞培养物药物组合物。

90、本发明还提供了一种前述的干细胞的制备方法，其包括：

91、将所述的核酸分子通过病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mrna转染导入干细胞。

92、在一些实施方案中，本领域技术人员可以通过本领域公知的方法和技术对干细胞进行遗传修饰，例如物理、化学或生物学方法，或其组合。例如，所述生物学方法包括使用病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。例如，所述化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠等；基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体等。例如，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等。

93、本发明中还涉及用途的保护，包括但不限于：

94、所述的干细胞、所述的细胞培养物、所述的提取物或所述的药物组合物在炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤中制药用途。

95、所述的干细胞、所述的细胞培养物、所述的提取物或所述的药物组合物在制备炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的诊断产品中的用途。

96、基于前述内容，本发明还提供一种用于非诊断目的的体外检测样品中的il-17a的方法。

97、所述方法包括以下步骤：

98、d1：所述的干细胞、所述的细胞培养物或所述的提取物与待测样品相接触；

99、d2：检测抗原-抗体复合物；

100、d3：判读结果。

101、基于前述内容，本发明还提供一种预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括：

102、向有需要的受试者施用治疗有效量的所述的干细胞、所述的细胞培养物、所述的提取物或所述的药物组合物；

103、所述的疾病为炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤。

104、所述的自身免疫性疾病包括但不限于：白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、anca相关性血管炎、cogan综合征、rs3pe综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、igg4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、i型糖尿病、缓慢进展型i型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性iga大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

105、优选地，所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。

106、所述的肿瘤包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、b细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。

107、本发明的有益效果：

108、本发明通过制备重组抗原免疫羊驼，筛选出具有il-17a特异性能力的纳米抗体，并针对性选择了两种纳米抗体进行串联，得到的il-17a特异性串联抗体，该串联抗体相对于串联前的单域抗体，具有更好的il-17a抗原结合能力和阻断活性，能够用于修饰干细胞特别是msc，有很好的临床应用前景。

109、本发明的修饰干细胞在多种动物模型中表现出较佳的效果，包括但不限于：

110、（1）胶原诱导的类风湿关节炎（ra）小鼠模型，相对于阳性抗体ixekizumab（1mg/kg）和huc-msc（修饰前）的治疗方案，在等同注射量（2×106个/只）条件下，msc治疗和g4-h10-msc治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显；试验终点试验终点g4-h10-msc治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组。在动物平均足爪厚度方面，本发明g4-h10-msc治疗效果显著优于阳性抗体ixekizumab和huc-msc；病理组织染色评分也显示，g4-h10-msc治疗效果显著优于阳性抗体ixekizumab和huc-msc；

111、（2）咪喹莫特涂抹法构建的银屑病（ps）模型中，在动物体重、皮肤临床评分和皮肤厚度上，g4-h10-msc治疗效果均显著优于阳性抗体ixekizumab和huc-msc；

112、（3）腹腔注射甘露聚糖构建银屑病关节炎（psa）模型中，在动物体重、足爪关节评分、皮肤临床评分方面，g4-h10-msc治疗效果均显著优于阳性抗体ixekizumab和huc-msc；且在动物血清炎症因子（tnf-α、il-6、il-23）方面，也表现出了相对于阳性抗体ixekizumab和huc-msc更优的效果（具有显著性差异）。