一种结合普通油茶苗性状的高产分子标记及育种方法

本发明涉及基因育种，更具体的说是一种结合普通油茶苗性状的高产分子标记及育种方法。

背景技术：

1、油茶(camellia oleifera abel.)是我国特有的木本油料树种，也是我国南方重要的木本食用油料物种。油茶主要种植在南方亚热带地区，广泛分布于南方丘陵地区，栽培面积大，其中普通油茶栽种面积最大。当前，油茶林产量相对较低，这与迅猛生长的茶油市场需求间存巨大矛盾，成为油茶产业发展面临的最主要困境之一。因此，培育高产油茶新品种是油茶产业稳健发展的关键。

2、数量性状呈连续性变异，受微效多基因的控制，易受环境影响。传统育种技术主要是针对表型的选择，选择和鉴定的结果易受环境影响而产生偏差。随着分子标记技术的发展，分子标记辅助选择(mas)为数量性状的高效选择提供了有效手段。通过关联分析发掘出有显著表型效应的候选基因的有益等位基因后，设计等位基因特异的pcr引物，进行标记的开发，并在遗传基础广泛的种质资源中对其进行验证，以用于广泛遗传背景下的mas，从而提高选择效率。利用功能标记进行mas，一方面选择的就是基因本身可以保证选择的准确性和提高选择的效率，另一方面利用关联分析，可以针对特定的影响性状变异的功能域进行选择保证了选择的效果。

3、在遗传育种中，产量属数量性状，为了提高选择的准确性，需要通过多年的种植和选择，油茶作为多年生木本植物，传统的杂交育种周期长，需花费十几二十年的时间、效率低，无法满足油茶现代产业化的快速发展。除此之外，还存在占用土地资源与人力成本高等问题，不能满足快速准确地根据育种目标进行选择的需求。分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)技术是利用与目标基因紧密连锁的分子标记来筛选优势基因型，获得目标个体的新兴技术，可以提高选择的准确性，缩短育种年限，提高育种效率。林木生长周期长是造成油茶育种见效晚的主要原因，但过早选择容易存在漏选与误选的风险，在苗期子代性状表达稳定，结合分子标记辅助选择，将会降低错选的风险。issr(inter-simple sequence repeats)简单序列重复区间，是一种显性标记，其操作简单，引物设计简单，多态性好，重复性高，实验成本低，实验稳定性高，是一种很好的dna指纹标记。

4、但目前在油茶中，分子标记技术主要应用于油茶遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析和杂种鉴定等领域，已开发了一些与茶油品质相关的分子标记，但尚未开发与产量紧密连锁的分子标记，也未见已开发的分子标记在杂交育种中应用的研究报道。

5、因此，如何开发一种与普通油茶产量紧密连锁的分子标记及育种方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种结合普通油茶苗性状的高产分子标记及育种方法。开发出了issr815和issr820这2个与普通油茶杂交种子培育的1年生实生苗性状紧密连锁的高产分子标记，获得815-6、815-3、820-7和820-8这4个基因位点，在自然群体中19个杂交家系中选择普通油茶高产优良家系和植株，选择效率均达75％，正确率为100％，按照该方法获得普通油茶高产家系，产量高，平均单位冠幅面产量为2.91kg/m2，远远高于平均单位冠幅面产量1.2kg/m2的国家行业标准；在每一个杂交世代中，2年内就可成功筛选出高产品种，相比于现有技术的十几二十年，极大缩短了育种周期，解决了现有油茶杂交育种周期长、稳定性差和效率低的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种结合普通油茶苗性状的高产分子标记，包括紧密连锁分子标记issr815和issr820；所述分子标记issr815包括815-3和815-6两个基因位点；所述分子标记issr820包括820-7和820-8两个基因位点；所述分子标记issr815扩增的引物序列为5'-ctctctctcctcctctg-3'，seq id no：1；所述分子标记issr820扩增的引物序列为5'-gtgtgtgtgtgtgtgtg-3'，

4、seq id no：2。

5、优选的，所述分子标记issr815的基因位点815-3和815-6与1年生普通油茶杂交种子培育的实生苗的水分利用效率呈显著相关；所述分子标记issr820的基因位点820-7和820-8与1年生普通油茶杂交种子培育的实生苗的苗高和高径比呈显著相关。

6、优选的，普通油茶单株产量与1年生普通油茶杂交种子培育的实生苗苗高呈极显著正相关，与高径比呈显著正相关，与水分利用效率呈显著负相关。

7、优选的，所述基因位点815-6和820-7为高产显性基因，基因位点815-3和820-8为高产隐性基因；基因位点815-6偏父性遗传，基因位点820-7偏母性遗传。

8、本发明的另一目的在于提供上述结合普通油茶苗性状的高产分子标记在普通油茶高产育种中的应用。

9、本发明的另一目的在于提供一种普通油茶高产育种的方法，包括如下步骤：

10、(1)亲本选取：选择10年以上盛产期单位冠幅面积产量大于1.2kg/m2的油茶树作为备选亲本，结合分子标记issr815和issr820辅助筛选亲本，选取显现815-6或820-7基因位点，且没有显现815-3和820-8基因位点的高产优株作亲本；

11、(2)亲本配置与杂交：选取步骤(1)中具有820-7基因位点的高产优株作为母本；选取具有815-6基因位点的高产优株作为父本，杂交，获得f1代；

12、(3)回交：选取f1代高产优株，作为母本，选取步骤(2)具有815-6基因位点的父本作为回交父本进行回交；选取回交子代中高产优株作为轮回母本，与步骤(2)具有815-6基因位点的父本多次回交，得回交子代；

13、(4)回交子代高产优株的筛选：结合普通油茶杂交种子回交子代培育的实生苗的生长性状以及基因型，在回交子代群体中筛选高产优株，包括如下步骤：

14、①结合表型筛选优良家系：在回交子代群体中，筛选回交子代实生苗高度或茎高比高于群体平均值30％，或水分利用效率低于群体平均值30％的家系，作为优良家系；

15、②利用分子标记，在步骤①筛选的优良家系中选择显现815-6或/和820-7基因位点，且没有显现815-3和820-8基因位点的回交子代的优良家系；

16、③结合表型在优良家系内筛选优良单株：在步骤②筛选的优良家系为基础，结合回交子代培育的实生苗的生长性状，筛选出：

17、a在家系群体中，筛选出杂交种子培育的1年实生苗的高度及茎高比最高的前10名的植株；

18、b在家系群体中，筛选出杂交种子培育的1年实生苗水分利用效率最低的后10名的植株；

19、c在家系群体中，筛选出要求a和b均存在的植株为回交子代的高产优株。

20、(5)在步骤(4)-③中筛选的回交子代高产优株，即为普通油茶高产品种。

21、优选的，所述步骤(1)中，当扩增出800bp的单一条带时，代表检测植株具有820-7基因；当扩增出900bp单一条带时，代表检测植株具有820-8基因；当扩增出650bp单一条带时，代表检测植株具有815-6基因；当扩增出250bp单一条带时，代表检测植株具有815-3基因。

22、优选的，步骤(3)中总的回交次数≥2次。

23、优选的，步骤(3)中f1代高产优株的筛选过程同步骤(4)中回交子代高产优株的筛选过程。

24、本发明的再一目的在于提供一种结合普通油茶苗性状高产分子标记的扩增引物组，包括分子标记issr815和issr820的扩增引物，所述分子标记issr815扩增的引物序列如seq id no：1所示；所述分子标记issr820扩增的引物序列如seq id no：2所示。

25、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

26、(1)本发明通过杂交群体构建，完成了普通油茶高产数量基因的累加及纯合，同时结合issr-pcr和1年生普通油茶杂交种子培育的实生苗的生长性状，开发并筛选与普通油茶高产紧密连锁的分子标记issr815和issr820，获得815-6、815-3、820-7和820-8这4个基因位点，在19个杂交家系中选择普通油茶高产优良家系和植株，选择效率均达75％，正确率为100％，按照该方法获得普通油茶高产家系，产量高，平均单位冠幅面产量为2.91kg/m2；筛选的高产优良植株的平均单位冠幅面产量为3.69kg/m2，远远高于平均单位冠幅面产量1.2kg/m2的国家行业标准。

27、(2)本发明育种方法能获得性状稳定且产量高的优株后代供于品种试验，在每一个杂交世代中，两年就可以成功获取高产优良品种，相比于现有技术需要十几二十年，极大缩短了育种周期，解决了现有油茶杂交育种周期长、稳定性差和效率低的问题。