基因NAT1和bHLH110在提高水稻高温抗性中应用

本发明涉及基因工程，具体涉及水稻基因nat1和bhlh110在提高水稻高温抗性中应用。

背景技术：

1、近些年随着工业化快速发展，温室气体排放加剧导致气温升高，给植物生长、农业生产带来巨大挑战。例如，2022年七月份高温席卷全国，多省陷入高温炙烤之中，连日遭遇40摄氏度以上高温。据估算，全球平均气温每升高1℃，水稻、小麦、玉米等主要粮食作物就会减产3-8％(zhao et al.,2017.temperature increase reduces global yields ofmajor crops in four independent estimates.proc.natl.acad.sci.usa,114:9326-9331)。世界粮农组织曾发表声明：由于气候变化，自2007年起，全球粮食产量下降了30％，且这种状况还在进一步恶化。水稻是我国主要粮食作物且大面积种植，对国家发展至关重要。农作物在生长过程中面临着诸多逆境，包括非生物胁迫和生物胁迫，但植物无法通过移动等手段来规避，只能调控生理生化代谢从而做出有效应答。研究水稻对高温胁迫的响应分子机制，创制耐高温育种材料，不仅是植物与环境互作的基础科学问题，也是我国实现种业振兴的国家重大战略需求。

2、本发明则是鉴定了一个负向调控因子nat1(negative regulator ofthermotolerance)，其突变体表现出高温抗性的特征。在分子机制上，nat1突变体表现出蜡质含量上升而增强高温抗性，这一过程是基因bhlh110介导实现的。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基因nat1和bhlh110在改良水稻高温抗性方面的应用，通过基因编辑技术获得高温抗性提高水稻材料，且不含转基因成分。本发明涉及的nat1基因是水稻7号染色体上一个锌指转录因子基因，编号为os07g0590100(rap编号)或loc_os07g40080(msu编号)。nat1 dna全长894bp，1个外显子，序列如seq id no.1所示。编码区cds全长606bp，序列如seq id no.2所示；编码202个氨基酸，具体序列如seq id no.3所示。nat1蛋白含有两个锌指结构域，一个ear结构域(erf-associated amphiphilic repression)。

2、水稻基因nat1与高温抗性有关，基因nat1的碱基序列如seq id no.1所示，其编码区序列如seq id no.2所示，其蛋白序列如seq id no.3所示。

3、本发明利用crispr-cas9基因编辑技术获得的nat1突变体水稻材料日本晴在高温抗性方面显著增强，包括幼苗期存活率及生殖期农艺性状提高。

4、突变体nat1的抗高温特性，解除对基因bhlh110的抑制作用。

5、基因bhlh110碱基序列如seq id no.4所示，其编码区序列如seq id no.5所示，其蛋白序列如seq id no.6所示。

6、bhlh110突变体高温抗性显著减弱；而bhlh110oe过表达植株高温抗性显著增强。

7、bhlh110促进蜡质合成基因cer1及cer1l表达，增加蜡质厚度，从而正向调控高温抗性。

8、基因cer1碱基序列如seq id no.7所示，其编码区序列如seq id no.8所示，其蛋白序列如seq id no.9所示。

9、基因cer1l碱基序列如seq id no.10所示，其编码区序列如seq id no.11所示，其蛋白序列如seq id no.12所示。

10、本发明提供一种利用nat1基因改变水稻高温抗性方面的应用，设计针对nat1基因的sgrna，采用crispr-cas9基因编辑技术，获得突变体植株。

11、nat1基因编辑靶点为gcaaggcgttcgcgtcgtacc，本发明提供设计并合成所需引物，经pcr扩增获得完整sgrna，以tkc载体为骨架构建获得转基因载体。引物设计如下：

12、osu6p-f：gtcgtttcccgccttcagtttatgtacagcattacgtagg

13、nat1-u6r:

14、ggtacgacgcgaacgccttgcaacctgagcctcagcgcagc

15、nat1-u6f:

16、gcaaggcgttcgcgtcgtaccgttttagagctagaaatagcaagtta

17、osu6t-r:

18、ctgtcaaacactgatagtttaaacgatggtgcttactgtttag

19、实验步骤如下：第一轮pcr分两管进行，均以带有u6启动子和终止子的载体为模板。pcr1：osu6p-f+nat1-u6r；pcr2：nat1-u6f+osu6t-r。将pcr1和pcr2的产物进行胶回收，随后分别取0.5μl作为模板，使用osu6p-f+osu6t-r作为引物来扩增，两个pcr小片段连接在一起。将回收的pcr产物与已经被pme i酶切完全的tkc载体相连。最后转化大肠杆菌获得阳性转化子后送测序。

20、本发明提供含有以上设计的crispr-cas9载体。

21、本发明提供含有以上crispr-cas9载体的大肠杆菌和农杆菌。

22、本发明提供利用农杆菌将设计的crispr-cas9载体转化到水稻品种日本晴中，筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：(1)构建工程菌：将构建的crispr-cas9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株eha105，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有阳性农杆菌。(2)crispr-cas9载体转化水稻愈伤组织并获得转基因阳性苗苗：用含有crispr-cas9载体的eha105侵染水稻愈伤组织，并于22℃培养室中共培养3天，用羧苄溶液洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养。经过3-4周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗。(3)鉴定靶点是否突变。引物序列为：nat1-ko seq f：gacagacgcaatcgcatgcaaacg,nat1-ko seq r：cagcagcaacgacgacgtctctgtg。pcr产物经测序确认是否突变，并选出其中两种突变类型用于后续实验。其中nat1-ko-1突变为在目标区域插入一个碱基a，nat1-ko-2突变则是插入碱基t，两者均引起移码突变。

23、一种水稻高温抗性基因，水稻基因nat1序列插入碱基a，其碱基序列如seq idno.13所示。水稻基因nat1序列插入碱基a后翻译所得蛋白，其氨基酸序列如seq id no.15所示。

24、一种水稻高温抗性基因，水稻基因nat1序列插入碱基t，其碱基序列如seq idno.14所示。水稻基因nat1序列插入碱基t后翻译所得蛋白，其氨基酸序列如seq id no.16所示。

25、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

26、本发明在水稻中利用基因编辑技术突变基因nat1，进一步探究水稻抗高温能力是否增强。本发明提供的基因及操作技术在提高水稻高温抗性方面具有显著作用，可以产生不含转基因载体的水稻材料，具有很高的应用价值。