结合SLC13A5膜蛋白的抗体的制作方法

本发明涉及抗体，具体地，涉及一种结合slc13a5膜蛋白的抗体，以及所述抗体的制备方法和应用。

背景技术：

1、溶质载体超家族(solute carrier fami ly,slc)是仅次于g蛋白偶联受体的第二大膜蛋白家族。slc膜转运蛋白，包括52个亚家族，400多个成员，它们的主要功能是介导各种营养物质和代谢产物的跨膜转运，包括金属离子、无机离子、有机离子、氨基酸、脂质、糖类、神经递质、核酸，药物及其他外源和内源性物质跨生物膜的流入和流出，在细胞吸收营养物质，药物及其他外源性物质的生理过程中发挥重要作用。slc13a5(uniprot:q86yt5)属于溶质转运第13家族的第5个成员，其编码钠依赖的柠檬酸转运蛋白nact(568aa)，负责将阴离子中间体柠檬酸从血液输送到细胞内，柠檬酸是细胞三羧酸循环的中间产物，在能量代谢中发挥重要作用，且脂肪酸的合成速率与柠檬酸的胞质浓度直接相关。slc13a5已成为肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病相关的极具潜力的治疗靶点[1,2]。

2、slc13a5含有11个跨膜区，其n端位于胞内，c端位于胞外。slc13a5同源二聚体膜蛋白通过结构构象变化将结合na+和柠檬酸的位点交替朝向细胞膜的内侧或外侧，以将柠檬酸从细胞外转运到胞内[3]。slc13a5是一种膜蛋白，由于膜蛋白表达量低，难以获得用于免疫的膜蛋白抗原，因此，目前亟需开发应用于诸如slc13a5等膜蛋白的检测、表征及疾病治疗的抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗slc13a5膜蛋白的抗体、制备所述抗体的方法以及所述抗体的应用。

2、本发明的第一方面，提供了一种抗slc13a5抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：

3、(z1)所述重链可变区包含以下3个cdr：seq id no:7所示的h-cdr1；seq id no:8所示的h-cdr2；seq id no:9所示的h-cdr3；以及

4、所述轻链可变区包含以下3个cdr：seq id no:13所示的l-cdr1；序列如tas所示的l-cdr2；seq id no:14所示的l-cdr3；或

5、(z2)所述重链可变区包含以下3个cdr：seq id no:18所示的h-cdr1；seq id no:19所示的h-cdr2；seq id no:20所示的h-cdr3；以及

6、所述轻链可变区包含以下3个cdr：seq id no:24所示的l-cdr1；序列如dts所示的l-cdr2；seq id no:25所示的l-cdr3。

7、在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区还包含fr区。

8、在另一优选例中，所述重链可变区包含鼠源或人源的fr区，和/或所述轻链可变区包含鼠源或人源的fr区。

9、在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或

10、所述抗体的轻链可变区包含如seq id no:12所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。

11、在另一优选例中，所述抗体包含氨基酸序列如seq id no:6所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no:12所示的轻链可变区。

12、在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或

13、所述抗体的轻链可变区包含如seq id no:23所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。

14、在另一优选例中，所述抗体包含氨基酸序列如seq id no:17所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no:23所示的轻链可变区。

15、在另一优选例中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

16、在另一优选例中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的或人源的。

17、在另一优选例中，所述重链恒定区来源于小鼠重链igg3或igg2b。

18、在另一优选例中，所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。

19、在另一优选例中，所述重链恒定区包含如seq id no:10或21所示的氨基酸序列。

20、在另一优选例中，所述轻链恒定区包含如seq id no:15所示的氨基酸序列。

21、在另一优选例中，所述抗体包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双链抗体、单链抗体(scfv)、fab、fab'、f(ab')2抗体。

22、在另一优选例中，所述抗体为重组抗体。

23、在另一优选例中，所述抗体为重组单克隆抗体，其包含氨基酸序列如seq id no:1所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:2所示的轻链。

24、在另一优选例中，所述重组单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no:3所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:4所示的轻链。

25、在另一优选例中，所述抗体包括动物源抗体(例如不同亚型的鼠源抗体)、嵌合抗体(例如人-鼠嵌合抗体)、人源化抗体。

26、在另一优选例中，所述抗体特异性结合人slc13a5。

27、本发明的第二方面，提供了一种重组抗体，所述的重组抗体具有：

28、(i)如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段的序列；以及

29、(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或用于纯化、检测的标签序列。

30、在另一优选例中，所述重组抗体具有促进抗体分泌表达的信号肽。

31、在另一优选例中，所述信号肽具有如seq id no:5、11、16或22所示的氨基酸序列。

32、在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：flag、myc、his标签等。

33、在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq id no:1所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:2所示的轻链。

34、在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq id no:3所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:4所示的轻链。

35、本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸分子，其编码选自下组的多肽：

36、(1)如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段；或

37、(2)如本发明第二方面所述的重组抗体。

38、在另一优选例中，所述多核苷酸分子包含如seq id no:27-30中任一项所示的核苷酸序列。

39、本发明的第四方面，提供了一种表达载体，其含有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。

40、在另一优选例中，所述载体包括真核细胞表达载体、原核细胞表达载体。

41、在另一优选例中，所述载体为哺乳细胞表达载体。

42、在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

43、本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有如本发明第四方面所述的载体，或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。

44、在另一优选例中，所述宿主细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)、原核细胞。

45、本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含：

46、(a)如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段或如本发明第二方面所述的重组抗体；和

47、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、酶、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、纳米颗粒/纳米棒。

48、在另一优选例中，所述可检测标记物包括荧光标记物或化学发光标记物。

49、在另一优选例中，所述放射性核素包括：诊断用同位素；和/或治疗用同位素。

50、在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

51、在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物。

52、在另一优选例中，所述细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、dna小沟结合试剂、dna复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。

53、在另一优选例中，所述抗体偶联物为抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)。

54、本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

55、(a)如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物；以及

56、(b)药学上可接受的载体。

57、在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。

58、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗与slc13a5相关的疾病或病症的药物。

59、在另一优选例中，所述与slc13a5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。

60、在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(nafld)。

61、在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。

62、本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物的用途，用于制备：

63、(1)用于预防和/或治疗与slc13a5相关的疾病或病症的药物；

64、(2)用于检测slc13a5分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒。

65、在另一优选例中，所述与slc13a5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。

66、在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(nafld)。

67、在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。

68、在另一优选例中，所述检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测、elisa检测、蛋白质免疫印记(wb)检测。

69、在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。

70、本发明的第九方面，提供了一种产生如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的重组抗体的方法，包括步骤：

71、(s1)在适合产生抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗体的培养物；

72、(s2)从所述培养物中分离或回收所述抗体；以及

73、(s3)任选地，纯化和/或修饰得步骤(b)中获得的抗体。

74、本发明的第十方面，提供了一种检测样品中slc13a5蛋白的方法，所述方法包括步骤：

75、(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物接触；

76、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在slc13a5蛋白。

77、在另一优选例中，所述样品包括：离体组织样品、细胞样品。

78、在另一优选例中，所述方面为体外方法。

79、在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。

80、本发明的第十一方面，提供了一种预防和/或治疗与slc13a5相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：给有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的抗slc13a5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

81、在另一优选例中，所述有需要的受试者包括人类或非人类哺乳动物。

82、在另一优选例中，所述与slc13a5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。

83、在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(nafld)。

84、在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。

85、本发明的第十二方面，提供了一种筛选抗slc13a5抗体的方法，包括步骤：

86、(s1)将人slc13a5的c端20aa(slc13a5 ctd)以非包膜vlp多价展示，用哺乳动物细胞表达，从而获得用于免疫的抗原蛋白slc13a5 ctd-vlp；

87、(s2)使用步骤(s1)中制备的抗原蛋白slc13a5 ctd-vlp免疫受试动物，收集经免疫后动物的抗血清；

88、(s3)检测收集的抗血清与抗原蛋白slc13a5 ctd-vlp的结合，若结合为阳性，则取经免疫后动物的脾脏，制备杂交瘤克隆；

89、(s4)用抗原蛋白slc13a5 ctd-vlp对杂交瘤克隆进行初筛，从而获得抗原结合阳性的杂交瘤克隆；

90、(s5)使用不含slc13a5 ctd序列的空vlp进一步对抗原结合阳性的克隆进行负筛选，筛选出只结合slc13a5 ctd的阳性杂交瘤克隆。

91、在另一优选例中，所述方法还包括以下步骤：

92、(s6)通过检测阳性杂交瘤克隆产生的单克隆抗体与表达slc13a5的细胞的结合，从而筛选具有slc13a5阳性表达细胞结合功能的单克隆抗体；以及

93、(s7)利用生物膜干涉技术(bli)表征阳性杂交瘤克隆产生的单克隆抗体与全长人slc13a5膜蛋白纳米磷脂盘(nanodisc)的结合。

94、在另一优选例中，所述slc13a5 ctd的氨基酸序列如seq id no:26所示。

95、在另一优选例中，所述哺乳动物细胞选自：hek293细胞、cho细胞。

96、在另一优选例中，所述受试动物选自：小鼠、大鼠、家兔、山羊、猴等。

97、在另一优选例中，所述步骤(s3)中的检测为elisa检测。

98、在另一优选例中，所述步骤(s4)和(s5)中的筛选均采用间接elisa法。

99、在另一优选例中，所述步骤(s6)中的表达slc13a5的细胞可选自表达slc13a5的肿瘤细胞，例如hepg2肝肿瘤细胞。

100、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。