一种T细胞无血清培养基及其制备方法与应用与流程

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种t细胞无血清培养基及其制备方法与应用。

背景技术：

1、t细胞是淋巴细胞的主要组分之一，是功能最复杂的一类细胞，具有多种细胞生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制b细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，在抵御疾病感染、防止肿瘤形成过程中起着关键的作用。

2、car-t/tcr-t细胞疗法是基于t细胞改造的一种治疗肿瘤的新型靶向疗法，可以识别特定肿瘤细胞，通过t细胞的细胞免疫作用，高效杀伤肿瘤细胞。近几年，car-t在治疗急性b淋巴细胞白血病中发挥了巨大的潜力，治愈率高达90％以上。car-t细胞治疗的流程包括患者外周血采集、分离t细胞、将car导入t细胞、体外扩增car-t细胞及最后将细胞回输至患者。所以，在整个过程中使用一个较为安全，无血清、无异源成分、所有组分化学明确，并能支持t细胞高密度培养的t细胞培养基至关重要。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明的第一个目的在于提供一种t细胞无血清培养基。该培养基不含有胎牛血清、无异源成分、所有组分化学明确。通过配方的优化可搭配细胞因子il-2、cd3及cd28单克隆抗体等激活t细胞，可支持人外周血或脐带血中的t细胞在体外的培养和快速增殖，并且能刺激更多比例的细胞响应表达ifn-γ，对肿瘤细胞有更强的细胞杀伤功能，对car-t细胞免疫治疗有重要的作用。

2、本发明的第二个目的在于提供一种上述t细胞无血清培养基的制备方法。

3、本发明的第三个目的在于提供上述t细胞无血清培养基在培养t细胞、car-t细胞或tcr-t细胞中的应用。

4、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案。

5、第一方面，本发明提供了一种t细胞无血清培养基，用于外周血或脐带血中t细胞的高密度培养和生长，所述t细胞无血清培养基由氨基酸类、无机盐类、维生素类及其他成分组成，其中：

6、所述氨基酸类的组成为：l-天冬氨酸30～550mg/l、l-谷氨酸300～1500mg/l、l-丝氨酸100～780mg/l、甘氨酸80～600mg/l、l-组氨酸盐酸盐一水合物100～850mg/l、l-精氨酸盐酸盐300～620mg/l、l-苏氨酸80～450mg/l、l-丙氨酸100～800mg/l、l-脯氨酸40～450mg/l、l-酪氨酸二钠盐二水合物120～750mg/l、l-缬氨酸100～450mg/l、l-甲硫氨酸30～250mg/l、l-异亮氨酸100～600mg/l、l-亮氨酸200～700mg/l、l-胱氨酸150～650mg/l、l-苯丙氨酸100～450mg/l、l-赖氨酸盐酸盐500～1100mg/l、l-色氨酸50～450mg/l、l-天冬酰胺一水合物200～800mg/l、l-半胱氨酸盐酸盐一水合物150～720mg/l、l-羟基脯氨酸0.2～20mg/l；

7、所述无机盐类的组成为：氯化钠500～1500mg/l、氯化钾200～1000mg/l、无水磷酸氢二钠100～550mg/l、无水硫酸镁100～600mg/l、碳酸氢钠350～3500mg/l、氯化钙50～550mg/l；

8、所述维生类的组成为：生物素0.001～0.1mg/l、叶酸0.02～2mg/l、肌醇5～85mg/l、vb12 0.002～2mg/l、氯化胆碱10～100mg/l、抗坏血酸1～50mg/l；

9、所述其他成分的组成为：重组人血白蛋白1～50g/l、重组人转铁蛋白0.001～0.1mg/l、重组人胰岛素0.002～10mg/l、四水硫酸锰0.0001～0.5mg/l、氯化亚锡0.0001～0.1mg/l、β-巯基乙醇0.05％～0.5％。

10、进一步的，所述t细胞无血清培养基由如下物质组成：

11、所述氨基酸类的组成为：l-天冬氨酸50～550mg/l、l-谷氨酸500～1500mg/l、l-丝氨酸200～780mg/l、甘氨酸80～500mg/l、l-组氨酸盐酸盐一水合物100～800mg/l、l-精氨酸盐酸盐300～600mg/l、l-苏氨酸100～450mg/l、l-丙氨酸200～800mg/l、l-脯氨酸100～450mg/l、l-酪氨酸二钠盐二水合物200～750mg/l、l-缬氨酸150～450mg/l、l-甲硫氨酸50～250mg/l、l-异亮氨酸100～500mg/l、l-亮氨酸260～700mg/l、l-胱氨酸150～600mg/l、l-苯丙氨酸150～450mg/l、l-赖氨酸盐酸盐550～1100mg/l、l-色氨酸100～450mg/l、l-天冬酰胺一水合物250～800mg/l、l-半胱氨酸盐酸盐一水合物200～720mg/l、l-羟基脯氨酸0.2～18mg/l；

12、所述无机盐类的组成为：氯化钠600～1500mg/l、氯化钾250～1000mg/l、无水磷酸氢二钠100～500mg/l、无水硫酸镁100～550mg/l、碳酸氢钠500～3500mg/l、氯化钙100～550mg/l；

13、所述维生类的组成为：生物素0.005～0.1mg/l、叶酸0.1～2mg/l、肌醇10～85mg/l、vb12 0.01～2mg/l、氯化胆碱20～100mg/l、抗坏血酸5～50mg/l；

14、所述其他成分的组成为：重组人血白蛋白1～45g/l、重组人转铁蛋白0.002～0.1mg/l、重组人胰岛素0.002～8mg/l、四水硫酸锰0.0001～0.4mg/l、氯化亚锡0.001～0.1mg/l、β-巯基乙醇0.1％～0.5％。

15、进一步的，所述t细胞无血清培养基由如下物质组成：

16、所述氨基酸类的组成为：l-天冬氨酸425.5mg/l、l-谷氨酸535.5mg/l、l-丝氨酸632mg/l、甘氨酸335mg/l、l-组氨酸盐酸盐一水合物524.5mg/l、l-精氨酸盐酸盐428mg/l、l-苏氨酸150mg/l、l-丙氨酸326.5mg/l、l-脯氨酸425mg/l、l-酪氨酸二钠盐二水合物632mg/l、l-缬氨酸200mg/l、l-甲硫氨酸167.5mg/l、l-异亮氨酸253mg/l、l-亮氨酸335mg/l、l-胱氨酸431mg/l、l-苯丙氨酸300mg/l、l-赖氨酸盐酸盐684mg/l、l-色氨酸360mg/l、l-天冬酰胺一水合物319.5mg/l、l-半胱氨酸盐酸盐一水合物584mg/l、l-羟基脯氨酸15mg/l；

17、所述无机盐类的组成为：氯化钠800mg/l、氯化钾450mg/l、无水磷酸氢二钠220.45mg/l、无水硫酸镁336.32mg/l、碳酸氢钠550mg/l、氯化钙421.3mg/l；

18、所述维生类的组成为：生物素0.01mg/l、叶酸0.5mg/l、肌醇20mg/l、vb12 0.8mg/l、氯化胆碱35mg/l、抗坏血酸15mg/l；

19、所述其他成分的组成为：重组人血白蛋白1.5g/l、重组人转铁蛋白0.08mg/l、重组人胰岛素0.03mg/l、四水硫酸锰0.002mg/l、氯化亚锡0.08mg/l、β-巯基乙醇0.3％。

20、在上述培养基中，所述重组人胰岛素选用药用gmp级别的重组胰岛素，可依据现有技术中已知的方法利用基因工程菌大规模表达和生产，其主要作用在于促进rna、蛋白质和脂肪酸的合成，还可以抑制细胞凋亡，是维持细胞存活的重要因子。

21、进一步的，所述重组人转铁蛋白为工程化hek-293细胞表达的重组人转铁蛋白，其主要作用在于提供铁离子等营养素促进细胞的生长，使细胞在无血清的条件下正常增殖，促进细胞外铁的储存和运输。

22、进一步的，所述重组人血白蛋白为水稻胚乳细胞表达的重组人血白蛋白，其主要作用在于调节免疫反应和炎症。

23、第二方面，本发明提供了一种上述t细胞无血清培养基的制备方法，该制备方法包括：取上述配方量的各组分溶解混匀，调节ph至7.0～7.5，调节渗透压至300～350mosm/kg，过滤除菌即得。

24、第三方面，本发明提供了上述t细胞无血清培养基在培养t细胞、car-t细胞或tcr-t细胞中的应用。

25、优选的，所述t细胞为外周血或脐带血中t细胞。

26、进一步的，培养t细胞的具体方法包括：

27、收集外周血或脐带血的单个核细胞；

28、将收集的单个核细胞用所述t细胞无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×106/ml，接种至包被有cd3和cd28单克隆抗体的微孔板中培养；

29、并且，添加il-2，培养11-13天，每隔1天补加所述t细胞无血清培养基，调整细胞密度至1×106/ml。

30、本发明的有益效果如下：

31、本发明的t细胞无血清培养基培养t细胞11-13天后，根据不同的个体差异，细胞扩增倍数可达到600-1500倍，且维持细胞活率在90％以上。

32、本发明的t细胞无血清培养基添加四水硫酸锰、氯化亚锡和β-巯基乙醇显著提高t细胞增殖能力及刺激更多比例的细胞响应表达ifn-γ。同时本发明培养基化学成分明确，且所含蛋白均为重组蛋白，非血浆来源。具体为人胰岛素是药用gmp级别的重组胰岛素；人转铁蛋白为工程化hek-293细胞表达的重组转铁蛋白，人血白蛋白为水稻胚乳细胞表达的重组人血白蛋白。重组蛋白可完美替代血浆来源蛋白，且避免来自于人源病毒及支原体污染的风险，安全性更高。重组蛋白批间差小，可提高细胞培养的重复性、准确性和稳定性，有利于培养基的临床及大规模转化。