一种肌肽N-甲基转移酶基因在提高L-鹅肌肽发酵产量中的应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种肌肽n-甲基转移酶基因在提高l-鹅肌肽发酵产量中的应用。

背景技术：

1、鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基l-组氨酸，anserine)是一种高度稳定的水溶性二肽，天然存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中，具有促进尿酸排泄，缓解高尿酸血症的作用，有较强的抗氧化、抗衰老等功能，可用作天然的抗氧化剂和降尿酸。

2、已有文献等人[1]的研究中，upf0586蛋白c9orf41同源体被鉴定为肌肽n-甲基转移酶，负责在大鼠肌肉中生成鹅肌肽。该研究通过表达和纯化大鼠、酵母、鸡和人类的upf0586蛋白同源体，证实了它们在生成鹅肌肽方面的活性。cao等人(2018年)[2]的研究探讨了肌肽n-甲基转移酶1(carnmt1)对组氨酸n1位点进行特异性甲基化的分子基础。guan等人(2023年)的研究[3]，展示了一种来自枯草芽孢杆菌的二肽水解酶bmpepd，该酶通过逆向水解实现了l-肌肽的高效合成。通过定点突变，他们得到了一个活性更高的变体t171n，为l-肌肽的生物合成提供了一种高效途径。cheng schwank-xu等人(2021年)的研究[4]，探讨了l-肌肽对辅酶q10生物合成的影响。在2型糖尿病小鼠模型中，l-肌肽增强了coq基因表达，并提高了肝脏coq的生物合成，显示了l-肌肽在调节线粒体功能和氧化应激中的潜在作用。但既往研究的酶活有限，生成鹅肌肽的产量也有限。

3、[1]j.,piecuch,m.,poleszak,o.,kozlowski,p.,chrobok,l.,baelde,h.,&de heer,e.(2015).upf0586 protein c9orf41 homolog is anserine-producingmethyltransferase.journal of biological chemistry,290(28),17190-17203.

4、[2]cao,r.,zhang,x.,liu,x.,li,y.,&li,h.(2018).molecular basis forhistidine n1 position-specific methylation by carnmt1.cell research,28(2),149-152.

5、[3]guan,b.-h.,yin,w.-t.,cao,b.,zhao,c.,pan,j.,&xu,j.-h.(2023).characterization and mutagenesis of a high-activity and highly substrate-tolerant dipeptidase for l-carnosine biosynthesis via reversedhydrolysis.molecular catalysis,113500.

6、[4]cheng schwank-xu,forsberg,e.,bentinger,m.,zhao,a.,ansurudeen,i.,dallner,g.,catrina,s.,brismar,k.,&tekle,m.(2021).l-carnosine stimulation ofcoenzyme q10 biosynthesis promotes improved mitochondrial function anddecreases hepatic steatosis in diabetic conditions.antioxidants,10(5),793.

技术实现思路

1、本发明提供的肌肽n-甲基转移酶基因，即表达tanmt、ggnmt2、acnmt或afnmt的基因，与ptrc99a质粒转运系统结合构成重组质粒，然后转化到敲除l-肌肽降解基因的大肠杆菌得到的基因工程菌株shk19k中，获得重组菌并发酵底物l-肌肽。最终发酵产物中，l-鹅肌肽产量显著高于原始菌株，具有工业放大优势，且降低了成本。

2、术语：

3、本发明中，carnosine nmt(n-methyltransferase)：一种酶，负责催化l-肌肽(l-carnosine)转化为l-鹅肌肽(l-anserine)。这种转化涉及一个甲基转移的过程，其中nmt酶起到关键作用。

4、本发明中，tanmt(tyto alba carnosine nmt)：是从某种生物(tyto alba，即普通仓鸮)中提取的一种特定的carnosine nmt酶。

5、本发明中，ggnmt2(gallus gallus carnosine nmt2)：是从另一种生物(gallusgallus，即家鸡)中提取的另一种carnosine nmt酶。

6、本发明中，acnmt(athene cunicularia carnosine nmt)：是从athenecunicularia(即洞穴猫头鹰)中提取的carnosine nmt酶。

7、本发明中，afnmt(aythya fuligula carnosine nmt)：是从aythya fuligula(即凤头潜鸭)中提取的carnosine nmt酶。

8、本发明中，重组菌株：经过基因工程修改的微生物菌株，这些菌株被设计为过表达(即以高水平产生)特定的酶，如carnosine nmt，以提高生产效率。

9、本发明中，摇瓶发酵：这是一种实验室规模的发酵方法，通常用于小规模生产或测试。在这种方法中，含有微生物和营养物质的瓶子在控制条件下摇动，以促进生长和代谢。本发明中，通过摇瓶发酵法生产l-鹅肌肽，在这种方法中，经过遗传改造的微生物(如细菌或酵母)被用来高效生产目标化合物，即l-鹅肌肽。

10、一方面，本发明提供了一种肌肽n-甲基转移酶基因在提高l-鹅肌肽发酵产量中的应用。

11、所述的肌肽n-甲基转移酶基因选自表达ggnmt2、tanmt、acnmt和afnmt的基因中的任一个或多个。作为优选，选自任一个。

12、具体地，所述的ggnmt2的氨基酸序列包括seq id no.1，或与seq id no.1序列同源性60％以上的序列；

13、所述的tanmt的氨基酸序列包括seq id no.2，或与seq id no.2序列同源性60％以上的序列；

14、所述的acnmt的氨基酸序列包括seq id no.3，或与seq id no.3序列同源性60％以上的序列；

15、所述的afnmt的氨基酸序列包括seq id no.4，或与seq id no.4序列同源性60％以上的序列。

16、seq id no.1：

17、meptpemkrnrlpsmnfeaeiladphdnselyvipsmrsltaeeyveafqsfldhstehqcmdefnkevmphimaglgngkstinilgvgsgtgeqdlkmiqilqaahpgvlinneiiepnpqhvaaykelvnrapdlqgvsftwhqltsseyeqqvkeknthkkfdfihmiqmlyrvedipntikffhsclnhqgklliiilsdssgwaslwkkyrhclpstdsghyitsdsitavlrklgikyhvyefpsgwditecfiegdpagghmmdfltgtknflgtapaalrsrlqealcqpecssrkdgrvifcnnlsmivaes；

18、seq id no.2：

19、megkrfnlangelqlsqeprqdqlptsiplpvshrdpgmdstspknrfpsmnfeaeiltdphdnselyvipsmrsltaeeyveafksfldhstehqcmdefnkeempnimaglgngrstinvlgvgsgtgeqdlkmirilqaahpgvlidneiiepnpqhvaaykelvnqapdlqnvsfiwhqltsseyeqqvkekgahkkfdfihmiqmlyrvedipntikffhsclnhhgklliiilsdssgwaslwkkyrhclpstdsgh yitsngitdvlkrlgveyhvyefpsgwditecfiegdpvgsrmmdfltgtknflgtapaglrqrlqealcqpecsskkdgriifsnnlsmivves；

20、seq id no.3：

21、mdptpemkrnrfpsmnfeaeiltashdnselyvipsmrsltaeeyveafksfldhstehqcmdqfnkeampnimaglgngkstinvlgvgsgtgeqdlkmirilqaahpgvlidneiiepnprhvaaykelvnqapdlqnvsfiwhqftsseyeqqmkekgahkkfdfihmiqmlyrvedipntikyfhscldhhgklliiilsdssgwaslwkkyrhclpstdsghyitsnsitdvlkrlgveyhvyefpsgwditecfiegdpvgghmmdfltgtknflgtappglrqrlqealcqpecsskkdgriifsnnlsmivves；

22、seq id no.4：

23、mepapemkrnrfpsmnfeaeilaaphdnselyvvpsmrsltaeeyveafksfldhstehqcmdefnkeemprimaglgngkstinvlgvgsgtgeqdlkmlrilqaahpgvlinneivepnpqhvaaykelvnqapdlqgvsfiwhqltsseyeqqvkekcinkkfdfihmiqmlyrvedipntikffhscldhqgklliiilsdssgwaslwkkyrhclpstdsghyitsdsitavlrrlgiqyrvhefpsgwditecfvegdpaggqmmdfltgtknflgtappalrrrlqealcqpecsskkdgrvifcnnlsmivves。

24、根据密码子简并性可知，在知晓氨基酸序列的前提下，本领域技术人员可以任意设计表达基因的具体序列。作为示例，本发明中提供了包括但不限于以下的基因：

25、所述的表达ggnmt2的基因包括seq id no.5所示的核苷酸序列，或与seq id no.5所示的核苷酸序列同源性60％以上，编码相同肌肽n-甲基转移酶的序列；

26、所述的表达tanmt的基因包括seq id no.6所示的核苷酸序列，或与seq id no.6所示的核苷酸序列同源性60％以上，编码相同肌肽n-甲基转移酶的序列；

27、所述的表达acnmt的基因包括seq id no.7所示的核苷酸序列，或与s eq id no.7所示的核苷酸序列同源性60％以上，编码相同肌肽n-甲基转移酶的序列；

28、所述的表达afnmt的基因包括seq id no.8所示的核苷酸序列，或与se q id no.8所示的核苷酸序列同源性60％以上，编码相同肌肽n-甲基转移酶的序列。

29、seq id no.5：

30、atggaaccgaccccggaaatgaaacgcaaccgtttaccgagcatgaactttgaagcggaaattctggccgatccgcatgataacagcgaactgtatgtgattccgagcatgcgcagcctgaccgcggaagaatatgtggaagcgtttcagagctttctggatcatagcaccgaacatcagtgcatggatgaatttaacaaagaagtgatgccgcatattatggcgggcctgggcaacggcaaaagcaccattaacattctgggcgtgggcagcggcaccggcgaacaagacctgaaaatgattcagattctgcaagcggcgcatccgggcgtgctgattaacaacgaaattattgaaccgaacccgcagcatgtggcggcgtataaagaactggtgaaccgcgcgccggatctgcaaggcgtgagctttacctggcatcaactgacgagcagcgaatatgaacagcaagtgaaagaaaaaaacacccataaaaaatttgattttattcatatgattcagatgctgtatcgcgtggaagatattccgaacaccattaaattttttcatagctgcctgaaccatcaaggcaaactgctgattatcattctgagcgatagcagcggctgggcgagcctgtggaaaaaatatcgccattgcctgccgagcaccgacagcggccattatattacgagcgatagcattaccgcggtgctgcgcaaactgggcattaaatatcatgtgtatgaatttccgagcggctgggatattaccgaatgctttattgaaggcgatccggcgggcggccatatgatggattttctgaccggcaccaaaaactttctgggcaccgcgccggcggcgctgcgcagccgcctgcaagaagcgctgtgtcagccggaatgcagcagccgcaaagatggccgcgtgattttttgcaacaacctgagcatgattgtggcggaaagctaa；

31、seq id no.6：

32、atggaaggcaaacgctttaacctggcgaacggcgaattacaactgagccaagaaccgcgccaagatcaactgccgacgagcattccgctgccggtga gccatcgcgatccgggcatggatagcacgagcccgaaaaaccgctttccgagcatgaactttgaagcggaaattctgaccgatccgcatgataacagcgaactgtatgtgattccgagcatgcgcagcctgaccgcggaagaatatgtggaagcgtttaagagctttctggatcatagcaccgaacatcagtgcatggatgaatttaacaaagaagaaatgccgaacattatggcgggcctgggcaacggccgcagcaccattaacgtgctgggcgtgggcagcggcaccggcgaacaagacctgaaaatgattcgcattctgcaagcggcgcatccgggcgtgctgattgataacgaaattattgaaccgaacccgcagcatgtggcggcgtataaagaactggtgaaccaagcgccggatttacagaacgtgagctttatttggcatcaactgacgagcagcgaatatgaacagcaagtgaaagaaaaaggcgcgcataaaaaatttgattttattcatatgattcagatgctgtatcgcgtggaagatattccgaacaccattaaattttttcatagctgcctgaaccatcatggcaaactgctgattatcattctgagcgatagcagcggctgggcgagcctgtggaaaaaatatcgccattgcctgccgagcaccgatagcggccattatattacgagcaacggcattaccgatgtgctgaaacgcctgggcgtggaatatcatgtgtatgaatttccgagcggctgggatattaccgaatgctttattgaaggcgatccggtgggcagccgcatgatggattttctgaccggcaccaaaaacttcctgggcacggcgccggcgggcttacgtcagcgtctgcaagaagcgctgtgtcagccggaatgcagcagcaaaaaagatggccgcattatttttagcaacaacctgagcatgattgtggtggaaagctaa；

33、seq id no.7：

34、atggacccgaccccggaaatgaaacgcaaccgctttccgagcatgaactttgaagcggaaattctgaccgcgagccatgataacagcgaactgtatgtgattccgagcatgcgcagcctgaccgcggaagaatatgtggaagcgtttaagagctttctggatcatagcaccgaacatcagtgcatggatcagtttaacaaagaagcgatgccgaacattatggcgggcctgggcaacggcaaaagcaccattaacgtgctgggcgtgggcagcggcaccggcgaacaagacctgaaaatgattcgcattctgcaagcggcgcatccgggcgtgctgattgataacgaaattattgaaccgaacccgcgccatgtggcggcgtataaagaactggtgaaccaagcgccggatttacagaacgtgagctttatttggcatcagtttacgagcagc gaatatgaacagcagatgaaagaaaaaggcgcgcataaaaaatttgattttattcatatgattcagatgctgtatcgcgtggaagatattccgaacaccattaaatattttcatagctgcctggatcatcatggcaaactgctgattatcattctgagcgatagcagcggctgggcgagcctgtggaaaaaatatcgccattgcctgccgagcaccgatagcggccattatattacgagcaacagcattaccgatgtgctgaaacgcctgggcgtggaatatcatgtgtatgaatttccgagcggctgggatattaccgaatgctttattgaaggcgatccggtgggcggccatatgatggattttctgacgggcaccaaaaactttctgggcaccgcgccgccgggcctgcgccaacgcctgcaagaagcgctgtgtcagccggaatgcagcagcaaaaaagatggccgcattatttttagcaacaacctgagcatgattgtggtggaaagctaa；

35、seq id no.8：

36、atggaaccggcgccggaaatgaaacgcaaccgctttccgagcatgaactttgaagcggaaattctggcggcgccgcatgataacagcgaactgtatgtggtgccgagcatgcgcagcctgaccgcggaagaatatgtggaagcgtttaagagctttctggatcatagcaccgaacatcagtgcatggatgaatttaacaaagaagaaatgccgcgcattatggcgggcctgggcaacggcaaaagcaccattaacgtgctgggcgtgggcagcggcaccggcgaacaagacctgaaaatgctgcgcattctgcaagcggcgcatccgggcgtgctgattaacaacgaaattgtggaaccgaacccgcagcatgtggcggcgtataaagaactggtgaaccaagcgccggatctgcaaggcgtgagctttatttggcatcaactgacgagcagcgagtacgaacagcaagtgaaagagaaatgcattaataaaaaatttgattttattcatatgattcagatgctgtatcgcgtggaagatattccgaacaccattaaattttttcatagctgcctggatcatcaaggcaaactgctgattatcattctgagcgatagcagcggctgggcgagcctgtggaaaaaatatcgccattgcctgccgagcaccgatagcggccattatattacgagcgatagcattaccgcggtgctgcgccgcctgggcattcagtatcgcgtgcatgaatttccgagcggctgggatattaccgaatgctttgtggaaggcgatccggcgggcggtcagatgatggattttctgacgggcaccaaaaactttttaggcaccgcgccgccggcgctgcgccgtcgcctgcaagaagcgctgtgtcagccggaatgcagcagcaaaa aagatggccgcgtgattttttgcaacaacctgagcatgattgtggtggaaagctaa。

37、本发明中，所述的同源性可以是60％以上，其所涵盖的可能的范围包括但不限于：70％以上、72％以上、75％以上、78％以上、80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、93％以上、95％以上、96％以上、98％以上或99％以上中的任一种或多种情况。

38、又一方面，本发明还提供了一种扩增前述的肌肽n-甲基转移酶基因片段的引物；

39、所述的表达ggnmt2的基因的引物，核苷酸序列包括seq id no.9和se q idno.10；

40、所述的表达tanmt的基因的引物，核苷酸序列包括seq id no.11和se q idno.12；

41、所述的表达acnmt的基因的引物，核苷酸序列包括seq id no.13和se q idno.14；

42、所述的表达afnm的基因的引物，核苷酸序列包括seq id no.15和seq id no.16。

43、seq id no.9：cacacaggaaacagaccatggaaccgaccccggaaatg；

44、seq id no.10：caggtcgactctagaggatccttagctttccgccacaatcatgct c；

45、seq id no.11：cacacaggaaacagaccatggaaggcaaacgctttaacctg；

46、seq id no.12：caggtcgactctagaggatccttagctttccaccacaatcatgct cagg；

47、seq id no.13：cacacaggaaacagaccatggacccgaccccggaaatg；

48、seq id no.14：caggtcgactctagaggatccttagctttccaccacaatcatgct cag；

49、seq id no.15：cacacaggaaacagaccatggaaccggcgccggaaatg；

50、seq id no.16：caggtcgactctagaggatccttagctttccaccacaatcatgct cagg。

51、再一方面，本发明还提供了一种提高l-鹅肌肽发酵产量的方法。

52、所述的方法中，包括：在敲除l-肌肽降解基因的基因工程菌中过表达前述的肌肽n-甲基转移酶基因，所述的n-甲基转移酶基因包括表达ggnmt2、tanmt、acnmt或afnmt的基因。

53、具体地，所述的过表达通过构建ptrc99a质粒载体实现。

54、具体地，所述的敲除l-肌肽降解基因的基因工程菌的基础出发菌为大肠杆菌w3110。

55、优选地，所述的敲除l-肌肽降解基因的基因工程菌的保藏号为cgmcc no.28838。

56、再一方面，本发明还提供了一种提高l-鹅肌肽发酵产量的肌肽n-甲基转移酶基因。

57、具体地，选自seq id no.5-8，或与seq id no.5-8具有同源性60％以上的基因。

58、又一方面，本发明中还提供了包括表达前述的肌肽n-甲基转移酶基因中的任一项的重组质粒。

59、具体地，所述的重组质粒的宿主细胞是大肠杆菌细胞。

60、具体地，所述的骨架质粒为大肠杆菌表达质粒载体。

61、具体地，所述的骨架质粒选自pez07、pacyc、petrc、puc19、pbr322或ptrc99a。

62、优选地，所述的骨架质粒为ptrc99a。

63、具体地，所述的肌肽n-甲基转移酶基因在ptrc99a质粒的插入位点为ncoi/bamhi。

64、具体地，所述的肌肽n-甲基转移酶基因的过表达通过构建重组质粒实现。

65、在一些具体的实施例中，所述的构建重组质粒的方法包括以下步骤：

66、(1)将肌肽n-甲基转移酶基因片段以1：2与ncoi/bamhi酶切回收的ptrc99a载体片段进行ez克隆构建；

67、(2)将重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min；

68、(3)加入tg1转化感受态细胞，混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μl复苏液体培养基lb；

69、(4)复苏培养1h后离心涂布含150mg/l氨苄西林抗生素的lb平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒ptrc99a-ggnm t2、ptrc99a-tanmt、ptrc99a-acnmt、ptrc99a-afnmt，编号phe592、phe593、phe595、phe596。

70、基于以上，本发明还提供包括前述的重组质粒的基因工程菌株。

71、本发明的有益效果：

72、本发明筛选出有助于提高l-鹅肌肽发酵产量的肌肽n-甲基转移酶基因，筛选到的表达tanmt、ggnmt2、acnmt或afnmt的基因在重组菌株中过表达后，摇瓶发酵将l-肌肽转化生成l-鹅肌肽，l-鹅肌肽的产量相较于现有技术有所提高，具有工业放大优势。

73、保藏证明

74、保藏菌株：shk19k；

75、分类命名：大肠埃希氏菌escherichia coli；

76、保藏编号：cgmcc no.28838；

77、保藏时间：2023年11月02日；

78、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。