甜瓜中抗旱相关基因CmPPR及其用途

本发明属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种，涉及甜瓜苗期抗旱性相关基因及辅助育种，具体涉及一个甜瓜中抗旱相关基因cmppr及其用途。

背景技术：

1、干旱严重胁迫植物的生长发育，是限制产量的主要环境因子。甜瓜作为葫芦科三大经济作物之一，广受世界范围内消费者的喜爱。露天栽培时的田间干旱以及设施栽培时由于灌水不足或灌溉不及导致的干旱会严重影响收获甜瓜的产量和品质。当前对于甜瓜干旱条件下生理生化特性的研究已较为全面与深入，但是从分子层面切入而进行的遗传基础上的研究还是以反向遗传学的思路为主，鲜有利用正向遗传学手段对甜瓜抗旱相关基因进行定位与功能验证的报道。挖掘定位甜瓜抗旱相关遗传变异位点并加以功能验证，开发对应的分子标记，对于提高育种效率、规避育种盲目性，促进节水抗旱型绿色农业的发展有着重要意义。

2、近年来，在对植株进行准确抗旱性评价的基础上，借助基因编辑等分子技术以及生物信息学手段，以模式植物拟南芥、水稻、番茄等为典型的部分抗旱相关基因及其机制被解析，其抗旱响应通路也越发明晰。围绕各抗旱指标，与干旱胁迫相关的脱落酸、细胞分裂素、生长素、赤霉素等植物内源激素，wrky、myb、nac等转录因子以及水通道蛋白、过氧化物酶、胚胎晚期富集蛋白（lea）等蛋白进行的基因组学、转录组学、蛋白组学以及代谢组学等多组学的研究使得我们对植物在干旱胁迫下的响应机制越发清楚，但仍有许多未知通路，还需更深入的研究。

3、21世纪初至如今，有许多关于甜瓜不同生育时期受到干旱胁迫时的外部形态、内部结构以及生理生化特性的研究。随着甜瓜基因组的解析完成（argyris j.m., ruiz-herrera a., madriz-masis p., sanseverino w., morata j., pujol m., ramos-onsins s.e., garcia-mas j. (2015) use of targeted snp selection for animproved anchoring of the melon (cucumis melo l.) scaffold genome assembly.bmc genomics, 16: 4），邢巧娟等人通过对peg模拟干旱胁迫下编码应答非生物胁迫的脂氧合酶相关基因cmlox01-18在甜瓜内的表达模式进行研究筛选出cmlox08、cmlox10和cmlox13三个基因，并利用沉默与过表达对其功能进行验证，通过对其启动子进行分析发现存在脱落酸（aba）、水杨酸（sa）以及茉莉酸甲酯（meja）响应元件，进一步揭示其干旱胁迫下的响应机制（邢巧娟. (2020). cmlox10和cmlox13在调控薄皮甜瓜耐旱及抗白粉病中的作用机制. 沈阳农业大学）。2017年土耳其研究团队对甜瓜干旱条件下lea基因家族进行了全基因组以及转录组分析，进一步确认了lea蛋白与甜瓜抗逆胁迫的关联性（altunoglu, y.c., baloglu, m. c., baloglu, p., yer, e. n., kara, s.. (2017). genome-wideidentification and comparative expression analysis of lea genes in watermelonand melon genomes. physiology and molecular biology of plants, (1), 23）。上述研究对于甜瓜抗旱性的相关研究主要集中在筛选抗旱指标，研究植株生理生化变化，再利用反向遗传学手段筛选对应相关基因，但尚无通过正向遗传学手段对甜瓜抗旱基因进行定位的报道。故而亟待利用遗传图谱对甜瓜抗旱基因进行挖掘定位以开发切实可靠的分子标记。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一个甜瓜中抗旱相关基因cmppr及其用途。

2、本发明的第一方面，提供了一个甜瓜中抗旱相关基因cmppr，该基因与苗期干旱复水存活率相关，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的第二方面，还同时提供了上述甜瓜中抗旱相关基因cmppr编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明的第三方面，还同时提供了鉴定甜瓜中抗旱相关基因cmppr的分子标记cmdsr(与甜瓜抗旱性cmppr基因有关的分子标记cmdsr (drought survival rate))的引物对，包括：

5、pa型正向引物：

6、5’-gaaggtgaccaagttcatgctctggctaaaacaacgtagccag-3’

7、pb型正向引物：

8、5’-gaaggtcggagtcaacggattctggctaaaacaacgtagccac-3’

9、反向引物：

10、5’-caggcttgtaaccaattgactgcat-3’

11、进一步地，引物(分子标记)可委托上海桑尼生物科技有限公司合成，在abiveriti96pcr仪上进行pcr扩增，并利用abi公司stepone荧光定量pcr仪检测荧光信号并分析基因分型。

12、本发明的第四方面，还同时提供了上述引物对的用途：用于甜瓜抗旱系或其后代辅助选择育种。具体为：

13、（1）提取待测甜瓜品种基因组dna；

14、（2）利用所述的引物对对待测甜瓜基因组dna进行pcr扩增；

15、（3）根据pcr产物荧光信号的差异，利用kraken软件，检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测甜瓜是否抗旱，其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与pa型正向引物的荧光接头颜色一致，则待测甜瓜为纯合aa型基因型，表型为抗旱型，若pcr扩增结果荧光信号颜色与pb型正向引物的荧光接头颜色一致，则待测甜瓜为纯合bb型基因型，表型为不抗旱；若pcr扩增结果荧光信号颜色均与pa型正向引物、pb型正向引物的荧光接头颜色不同，则为杂合ab基因型。

16、进一步地，所述步骤（2）中，pcr扩增时，pcr反应体系为：20～50ng/μl甜瓜基因组dna 5.0μl，kasp master mix 5.0μl，kasp assay mix(pa型正向引物： pb型正向引物：反向引物＝2:2:5的摩尔浓度比)0.14μl，共10.14μl；

17、pcr程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性) ；61℃(-0 .6℃/循环)退火60s， 10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。

18、进一步地，扩增结束后，利用bmg pherastar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全，从kraken软件中导出实验结果。

19、按照本发明的设定，扩增26个循环，即能实现分型完全。

20、本发明的有益效果是：

21、发明人经过多年研究，发现甜瓜苗期干旱复水存活率与抗旱性高度相关。通过利用苗期干旱复水存活率差异的甜瓜种质构建ril遗传群体，针对抗旱性指标进行精细定位，发现一个五肽重复序列超家族蛋白(ppr)基因，该基因与甜瓜抗旱相关，其编码区在抗旱种质和不抗旱种质间存在一个非同义突变(nonsynonymous snp)，经验证该位点突变与甜瓜抗旱性密切相关。基于该snp开发分子标记cmdsr标记和引物对，能用于甜瓜节水抗旱型的分子辅助育种。