Pi-Pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用

本发明涉及生物，具体来说是一种 pi-pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用。

背景技术：

1、稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的病害，稻瘟病的有效防治，对水稻生产的可持续性发展和世界粮食安全至关重要。新的抗稻瘟病基因，尤其是广谱抗稻瘟病基因的鉴定和在水稻育种中的应用，是防控稻瘟病最经济有效的措施。

2、目前为止，已经鉴定的稻瘟病主效抗性基因位点146个，但克隆研究的只有38个。一些基因在水稻抗病育种中被广泛利用，在稻瘟病防治中发挥了重要作用。例如从籼稻’modan’中鉴定的编码卷曲的cc-nbs-lrr蛋白pb1，已被引入日本商业种植的几个优良品种中，并且在近30年内未表现出抗性丧失的迹象。何祖华等人在我国农家品种的育种材料中鉴定了一个广谱持久抗瘟性新位点pigm，它是一个包含多个nbs-lrr类抗病基因的基因簇。利用pigm改良选育的品种既有广谱持久抗病性又不影响最终的产量。

3、我们在水稻中鉴定了一个新的负调控水稻稻瘟病抗性的mirna，mir9664，其预测的靶基因主要是编码nbs-lrr蛋白的基因，其中预测靶基因 loc_os12g13550的表达水平在过表达mir9664的转基因水稻中显著下调，而在敲除mir9664的转基因水稻中显著上调，推测其很可能是一个受表观遗传调控的主效抗稻瘟病基因，在水稻稻瘟病防控中具有重要的潜在应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种 pi-pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明以水稻mir9664预测靶基因 loc_os12g13550为对象，从水稻子预44中提取总rna并反转录成cdna，用pcr技术扩增出 loc_os12g13550基因的cds区序列2883bp（如seq id no.1所示），编码包含一个蛋白磷酸激酶1调节亚基42（protein phosphatase 1 regulatory subunit 42）的cc-nbs-lrr抗病蛋白，这是第一个发现的具有磷酸激酶结构域的抗病蛋白（图1），我们将其命名为 pi- pprs42。

3、基因序列sqe id no.1所示，编码的氨基酸序列如sqe id no.2所示。通过构建 pi- pprs42基因过表达载体，采用农杆菌介导的遗传转化方法，将过表达载体导入感病水稻tp309中，得到 pi- pprs42基因过表达植株。过表达 pi- pprs42基因的水稻株系显著增强了对稻瘟病菌的抗性，t1代阳性转基因株系分蘖期离体叶片伤害接种稻瘟病菌a7203-8、hn2、guy11和lp11分生孢子悬浮液（1.0×105个/ml），转基因株系平均病斑长度、真菌孢子量均显著低于非转基因tp309对照。表明 pi- pprs42能显著增强水稻对不同致病稻瘟菌株的抗性。dab（3,3’diaminobenzidine-hcl）染色检测水稻叶片细胞h2o2累积表明，过表达 pi- pprs42基因的水稻植株，受稻瘟病菌侵染后48 h叶片细胞中h2o2的积累显著高于非转基因的tp309对照。qrt-pcr 方法对防御相关基因 ospr1a和 ospbz1，ja和sa途径信号通路关键基因 oscoi1b和 osnpr1的表达水平检测结果表明，与对照相比，过表达 pi- pprs42基因的水稻植株中 os pr1a、  ospbz1、osnpr1和  oscoi1b的表达显著上调。

4、上述结果表明， pi- pprs42通过增强水稻植株体内h2o2的积累，激活防御相关基因表达而赋予水稻的广谱稻瘟病抗性。

5、因此，本技术请求保护seq id no.1所示 pi-pprs42基因在提高水稻抗稻瘟病中的应用。

6、对于本领域技术人员来说，利用如seq id no.1所示 pi-pprs42基因序列来进行水稻新品种培育也属于本发明的保护范围。

7、本方法将 pi-pprs42目的基因在水稻品种tp309中过表达，实现了抗性提高，因此本方法亦可以用于水稻的改良或新品种选育也属于本发明的保护范围。

8、利用如seq id no.1所示 pi-pprs42基因或编码的氨基酸在提高水稻抗稻瘟病的方法，步骤包括：

9、（1）从野生型水稻子预44中提取总rna，然后反转录为cdna；

10、（2）用pcr技术扩增出目的基因 pi-pprs42，所述目的基因 pi-pprs42序列如seq idno.1所示；

11、（3）将基因 pi-pprs42片段连接到表达载体上，得到过量表达 pi-pprs42目的基因的质粒pcambia1300- pi-pprs42；

12、（4）将质粒pcambia1300- pi-pprs42导入农杆菌；

13、（5）含有质粒pcambia1300- pi-pprs42的农杆菌与水稻株共培养即可得到抗病性正相关的水稻株系。

14、进一步的，步骤（2）中，于扩增所述目的基因 pi-pprs42的引物序列为pi-pprs42-f和pi-pprs42-r：

15、pi-pprs42-f:5¢- attcgagctcggtaatgtcgacgatggtggtgag-3¢

16、pi-pprs42-r:5¢-aggatccccgggtactacttacatgcaactgttt-3¢。

17、本发明的有益技术效果是：本发明提供了一种通过负调控水稻抗病性的mirna靶基因的表达研究，克隆了一个新的广谱抗稻瘟病基因 pi- pprs42， pi- pprs42基因在水稻植株中受稻瘟病菌侵染诱导表达，过表达 pi- pprs42基因的水稻植株通过增强活性氧h2o2积累、防御相关基因 pr1a和 pbz1，sa和ja途径关键基因 osnpr1和 oscoi1b的表达赋予水稻广谱稻瘟病抗性。本研究为稻瘟病抗性基因的鉴定提供了新思路和新方法，为水稻品种抗性改良和广谱抗病新品种的选育提供了新的基因资源。