基于495个Y染色体SNP遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒的制作方法

本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种基于495个y染色体snp遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒。

背景技术：

1、y染色体是一类仅存在于男性个体的染色体，其 95％区域为非重组区non-recombination regions of y chromosome，nry，(以下未做特殊说明的y染色体均指非重组区)具有父系遗传、非重组、有效群体小和在生物地理学上具有特殊性等特点，使其在法医学方面，发挥着重要作用。然而，由于y-str突变率很高(约10-3)，同一父系的个体可能会发生突变而呈现出不同的y-str分型，这阻碍了对样本来源的推断。因此，解决y-str突变造成的潜在混淆，是法医学需要解决的科学问题。

2、y染色体单核苷酸多态性(y chromosomal single nucleotide polymorphism，y-snp)突变率比y-str低的多(约10-9 )，同一父系个体发生突变的概率很低，据此已经建立了y染色体进化树。在人类的起源、进化、迁移的研究中，遗传学家能够通过y染色体进化树来估算某一个群体或人种最近的共同祖先存在的时间，从而为预测潜在的地理或祖先起源提供线索。不断发展的检测技术为y染色体进化树的构建提供了验证和优化，越来越多的y-snp位点得以被发现，这在极大程度上扩充了y染色体进化树，使得单倍群的划分可以愈发精细。截至2016年5月18日，国际遗传系谱学会 (international society of geneticgenealogy，isogg)在线提供的可用于构建y染色体进化树的y-snp位点已达58198个。细分之下的y染色体进化树能追溯到更短世代数内的最近共同祖先。这启发我们运用y-snp单倍群克服在法医学溯源过程中因y-str突变造成的不利影响。来自同一父系的个体包括亲缘关系较远的个体均拥有完全相同的y-snp单倍群分型，可对应于y染色体进化树上的同一分枝。因此，若未知男性检材与参比父系单倍群不一致，则表明共祖关系发生在更远的时间，可排除来自于同一父系。若单倍群一致，则不能排除来自同一个父系。显然，对同一父系的确信，要依赖于单倍群细分程度与所使用遗传标记的密度。但是，仅为重建局部区域内的父系而使用目前现有最高分辨率y染色体进化树(http://www .isogg .org/tree/index.html)是繁琐且耗时的。vanoven等人用759个snp位点构建了一个最小参考树，提供了各主要单倍群在各大洲的分布概况，但该树分辨率较低，极大地限制了在实际应用中对某一区域内未知男性检材的具体来源推测。因此，需要选取最具代表性、最合理的y-snp构建一个非冗余的、高分辨率的y染色体进化树，同时，该树必须具有稳定且完整的拓扑结构。

3、特异性y染色体进化树的完整性有赖于各级分枝代表性snp位点(包括indel位点)的无缺漏纳入，但使用法医传统的检测方法，如snapshot、焦磷酸测序等，无法进行多样本、大量snp位点的连续检测。二代测序技术在准确性和高通量方面具有巨大优势，适用于多样本、多y-snps的检测。将其作为技术手段使我们在构建高分辨率y染色体进化树时，不会因检测限制而被迫减少y-snp和分枝数目，从而在每一次的检测中都保证了体系的完整性，避免分型错误。

4、综上所述，急需筛选一组适宜的y-snp遗传标记，应用二代测序技术，构建一个非冗余的、高分辨率的完整y染色体进化树的二代测序体系，为法医溯源提供一种新的技术手段。在现有技术中运用的y染色体法医学试剂盒，通常为100多个y染色体的snp遗传标记，无法其分辨率较低，为了提高保证了体系的完整性，避免分型错误亟需一种具备高分辨率的法医试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种基于495个y染色体snp遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒以解决对未知来源的男性生物性检材在y染色体进化树上的位置进行高分辨率划分，从而准确推断其男性血统来源。

2、本发明通过下述技术方案实现：一种基于495个y染色体snp遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒，可以包括复合扩增引物混合物；所述的复合扩增引物混合物包含了495个y-snp遗传标记的共计990条扩增引物。

3、进一步地，复合扩增引物的核苷酸序列分别如seq id no .1 至seq id no .495所示。

4、进一步地，试剂盒还可以包括dna提取试剂、pcr扩增试剂、测序文库构建试剂、核酸纯化试剂中的至少一种。

5、进一步地，试剂盒还可以包括复合扩增反应混合液；具体为赛默飞公司ionampliseq library kit 2 .0提供的pcr反应混合液。

6、进一步地，试剂盒还可以包括标准dna。

7、进一步地，标准dna可以为007标准dna。

8、为实现本发明的技术目的，本发明还提供了一种基于495个y染色体snp遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒的应用，根据如上所述的的检测试剂盒，其具有如下任一所述的用途：（1）在祖源推断中的应用；（2）在表型推断中的应用；（3）在个体识别中的应用；（4）在亲缘关系鉴定中的应用；（5）在混合复杂样本分型中的应用；（6）在二代dna档案建立中的应用；（7）在对未知来源的中男性样本进行单倍群划分中的应用。

9、为实现本发明的技术目的，本发明还提供了一种基于495个y染色体snp遗传标记的高分辨率法医学捕获检测试剂盒的检测方法。

10、包括如下步骤：s100、多重pcr反应，配制30ul的反应体系，进行第一多重pcr反应，其中，反应条件设置为热盖105℃，预变性温度为95°c，持续时间为3min30s，循环次数为30次，然后在72℃持续5min；s200、第一磁珠纯化反应，使用磁珠、80%乙醇以及无核酸酶水，其中磁珠需提前从4℃冰箱中取出，混匀并置于室温平衡30min，在外加磁场的情况下，吸附了核酸分子的磁珠与溶液发生分离，清洗磁珠进一步去除污染物，经过磁珠，无核酸酶水和两次80%乙醇的清洗，得到多重扩增子产物；s300、接头序列pcr反应，置30ul的反应体系，进行第二多重pcr反应，反应条件设置为热盖105℃，预变性温度为95℃，持续时间为3min30s，循环次数为9次，然后在72℃持续5min；s400、第二磁珠磁化，珠纯化反应，使用磁珠、80%乙醇以及无核酸酶水，其中磁珠需提前从4℃冰箱中取出，混匀并置于室温平衡30min，在外加磁场的情况下，吸附了核酸分子的磁珠与溶液发生分离，清洗磁珠进一步去除污染物，经过磁珠，无核酸酶水和两次80%乙醇的清洗，得到是纯化后的文库产物；s500、文库定量及质检，使用赛默飞qubit仪器进行浓度测定，文库质检用于对文库片段大小进行测定；s600、二代测序，通过文库质检的样本可进入二代测序平台进行测序。进一步地，二代测序平台可以为华大基因平台。

11、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

12、1、本发明的检测方法，通过对引物和探针的进行了独特设计，通过精心选择的495个y染色体snp遗传标记点位，极大地扩展了y染色体的选择范围，极大地提高了试剂盒的分辨率，将试剂盒的分辨率从原来的百级别提高到了千级别，同时优化设计了pcr反应体系、实时监测技术应用和对照样本的应用等核心方案，在提高分辨率的同时解决了现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、结果不稳定等问题；2、本发明提供的试剂盒具有操作简便、快速准确、结果稳定和高特异性的优点，应用范围广；3、本发明提供的试剂盒采用了单管内复合扩增和具备更高通量的二代测序技术，可以一次性获得多个男性来源生物性检材的495个y-snp遗传标记的基因分型能够快速实现对生物性检材的来源地溯源，具有好的应用前景和推广价值。