一种RSV重组蛋白疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种呼吸合胞病毒重组蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种常见的病毒，主要通过空气传播，是人下呼吸道感染的主要病原体。rsv感染可导致轻度至重度的呼吸道疾病，包括支气管炎、肺炎、哮喘发作等。尤其对于早产儿、低出生体重儿和免疫系统较弱的儿童和老年人，rsv感染可能导致严重的并发症，甚至死亡。

2、rsv对人类健康已构成严重威胁。据统计，2019年全球rsv相关的急性下呼吸道感染次数高达3300万人次，因rsv所致的急性下呼吸道感染住院次数和死亡病例分别为360万人次、26300例；在0～6月龄的婴儿中，rsv所致急性下呼吸道感染发生次数、住院次数及住院死亡病例分别约为660万人次、140万人次、13300例。此外，成年人的rsv感染率随年龄的增加而升高，老年人是易感人群之一，且老年感染者的预后较差、经济负担较重，65岁以上老年人的住院病死率最高，特别是随着人口的老龄化趋势加重，老年人口数量不断增长，应引起重视。几十年来由于因rsv感染而导致的住院或死亡，不仅造成了对生命的威胁，对医疗系统的治疗开支也造成很大的负担，因此，研发一款能够预防rsv病毒的疫苗，变得尤为重要和紧迫。

3、rsv是一种有包膜的非节段性单股负链rna病毒，属于单胞病毒目、肺炎病毒科、正肺病毒属。其基因组由编码11种蛋白(包括9种结构蛋白(3种糖蛋白和6种内部蛋白)和2种非结构蛋白)的单链负义rna分子组成。结构蛋白包括3种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白g、融合蛋白f和小疏水sh蛋白。存在两种rsv亚型：a和b，其差异主要在于g糖蛋白，而f糖蛋白的序列在两种亚型之间更保守。

4、rsv融合蛋白(f蛋白)属于i类跨膜蛋白，由574个氨基酸残基组成。在宿主细胞内最初生成为f蛋白的前体f0，f0蛋白在高尔基体上糖基化，随后通过细胞内弗林蛋白酶水解释放出27个氨基酸组成的多肽pep27，在该肽段的n和c端切割位点分别产生f1和f2两个亚基，f2亚基由信号肽sp和七肽重复序列hrc组成，f1亚基由融合肽fp、七肽重复区hra和hrb、domain i和domain ii跨膜区tm以及胞质域cp组成，f1和f2通过二硫键连接，形成一个异二聚体。三个异二聚体组装成一个成熟的f蛋白三聚体。rsvf蛋白三聚体不稳定，存在融合前(prefusion)和融合后(postfusion)两种构象。在病毒包膜表面的f蛋白最初为亚稳态的pre-f构象，当病毒吸附到细胞膜表面后，pre-f蛋白在细胞受体、温度和离子浓度等因素的触发下，其构象发生改变，生成高度稳定的post-f三聚体，该过程释放能量，可介导病毒包膜与细胞膜发生融合。由于pre-f的构象高度不稳定，因此，在体外分离纯化得到的蛋白通常为post-f。但亚稳态的pre-f构象是病毒介导膜融合过程所必需，也是诱导人体产生免疫应答的重要抗原。

5、pref蛋白作为rsv的主要抗原之一，具有较好的免疫原性，但是由于天然的pref蛋白在高温、高压、重金属离子、氧化剂、极端ph等条件下容易遭到破坏，蛋白结构稳定性差，难以保证其较好的抗原性，因此需要根据对pref蛋白结构和功能作进一步研究。研究表明，通过对pref蛋白进行氨基酸突变修饰，可提高其免疫原性和稳定性。其中rsvf蛋白呈其融合前构象的三维结构，它在其膜远端顶端呈现独特的抗原位点(“抗原位点o”)使用融合前f的三维结构作为指导，利用工程改造并构建融合前f的稳定化形式(“pref”抗原)，在rsv中和免疫反应中，免疫反应相比于利用先前基于rsvf蛋白的免疫原所实现的免疫反应大许多倍，并且其在动物实验中可提供针对rsv激发的免疫保护。

6、然而，具体如何设计获得稳定性高且免疫效果好的pre-f重组蛋白仍然存在着诸多挑战，并且目前我国还没有相关rsv重组蛋白疫苗产品上市。因此，需要衍生自rsvf蛋白的免疫原，其与相应的天然rsvf蛋白相比具有改善的特性，诸如pref增强的免疫原性或改善的稳定性，以及包含这种免疫原的组合物(例如疫苗)，都具有十分重要的临床意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种rsvpre-f重组蛋白疫苗及其制备方法。本发明是通过对rsv pre-f蛋白的氨基酸序列进行合理的优化设计，从而获得稳定性增强的rsv pre-f重组蛋白疫苗。该疫苗进一步增强了pre-f蛋白免疫原性和稳定性，可有效预防由rsv感染引起的疾病，增强疫苗的保护效果，且对加大国产化产品的研发及加快我国疫苗和药物临床试验的开展，以最大程度保护儿童、老人免遭rsv感染相关疾病的侵害，弥补高危人群rsv感染的干预措施的不足，都具有十分重要的意义。

2、本发明解决技术问题的技术方案具体如下：

3、在本发明的第一方面，提供了一种rsv重组蛋白，所述的rsv重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的rsv pre-f重组蛋白，所述的突变修饰方式选自下列方式中的任意一种：

4、(1)在序列如seq id no.1所示的野生型pre-f蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变，将第41位的s突变为c，第409位的s突变为c；

5、(2)先将序列如seq id no.1所示的野生型pre-f蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其c末端连接fibritin/throm/6his/stretaq序列，得到序列如seq id no.2所示的突变体，再在seq id no.2序列基础上再进行氨基酸点突变，将第41位的s突变为c，第409位的s突变为c。

6、进一步地，所述的rsv重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

7、进一步地，所述rsv pre-f重组蛋白为三聚体。

8、进一步地，所述rsvpre-f重组蛋白包含三个f单体，所述单体中至少两个包含引入的半胱氨酸残基，所述引入的半胱氨酸残基彼此紧密接近并形成使所述rsvpre-f蛋白稳定的二硫键。

9、在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述rsv重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：将编码如第一方面所述rsv蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述rsv重组蛋白。

10、进一步地，所述的制备方法，包括如下步骤：将编码如第一方面所述rsv重组蛋白的核酸分子导入cho细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述rsv重组蛋白。

11、在本发明的第三方面，提供了一种生物材料，为下述(1)-(4)中至少一种：

12、(1)编码如第一方面所述rsv重组蛋白的核酸分子；

13、(2)含有(1)所述核酸分子的重组表达载体；

14、(3)含有(1)所述核酸分子的重组微生物或含有(2)所述重组表达载体的重组微生物；

15、(4)含有(1)所述核酸分子的重组细胞系或含有(2)所述重组表达载体的重组细胞系。

16、在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述的rsv重组蛋白或按照如第二方面所述方法制备得到的蛋白或如第三方面所述的生物材料在如下(1)-(4)任一种中的应用：

17、(1)作为免疫原；

18、(2)制备抗rsv的产品；

19、(3)制备预防和/或治疗rsv感染的产品；

20、(4)制备预防和/或治疗rsv所致疾病的产品。

21、在本发明的第五方面，提供了一种疫苗，其活性成分为如第一方面所述的rsv重组蛋白或按照如第二方面所述方法制备得到的蛋白或如第三方面所述的生物材料。

22、进一步地，所述疫苗的制剂形式为水剂或冻干剂。

23、进一步地，所述疫苗中含有佐剂。

24、进一步地，所述的佐剂为cpg、qs21、磷酸铝、cpg与磷酸铝混合物、或qs21与磷酸铝混合物中的任意一种。

25、在本发明的第六方面，提供了如第五方面所述的疫苗在如下(1)-(3)任一种中的应用：

26、(1)制备抗rsv的产品；

27、(2)制备预防和/或治疗rsv感染的产品；

28、(3)制备预防和/或治疗rsv所致疾病的产品。

29、本发明具有如下技术效果：

30、(1)本发明通过基因工程手段对rsv蛋白的氨基酸序列进行合理的优化设计，所述经氨基酸突变修饰的rsvpre-f重组蛋白与相应的野生型rsvf蛋白相比具有增加的稳定性，其中所述稳定性通过所述突变体与抗体pa1、pa2的结合来测量。该疫苗主要是对pref蛋白氨基酸进行突变修饰，可使得蛋白在不同环境下，包括高温、酸性及高渗透压下仍然保持其结构稳定性及抗原簇功能，即使经历化学反应后，仍然能够保存其较好的抗原性。

31、(2)本发明通过对rsv特异性抗原氨基酸突变设计增强了pre-f蛋白结构的稳定性，解决了野生蛋白抗原稳定性差的问题。通过实验证明：本发明制备的经修饰后pre-f蛋白在不同温度、ph及渗透压下的稳定性均明显优于修饰前pre-f蛋白，并且在高温、酸性及高渗透压处理后的修饰后pre-f蛋白仍然表现出了较高的抗原结合活性。

32、(3)本发明通过将rsvpre-f蛋白进行氨基酸突变设计，在保证蛋白结构稳定性的同时，可有效诱导生物体内具备中和活性的rsv抗体，从而赋予机体有效的免疫保护。通过实验证明：相较于修饰前rsvpref蛋白，本发明制备的经氨基酸修饰后pref重组蛋白疫苗免疫小鼠后，可以获取到高保护效价的血清，并且小鼠血清针对rsva2病毒可产生较高的中和抗体滴度。