产虾青素的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用

本发明涉及基因工程，特别是一株高产虾青素的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用。

背景技术：

1、巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养酵母，具有很强的呼吸代谢能力，因此在简单培养基中生长到非常高的细胞密度，也可以很容易地从摇瓶扩大到大规模生物反应器。因此，巴斯德酵母的综合特性使该菌株在生产类胡萝卜素等化合物方面具有巨大的潜力。最近的研究已经证明，巴斯德氏菌适合于生产透明质酸、类胡萝卜素和倍半萜（+）-诺卡酮等天然产物。与其他微生物相比，巴斯德毕赤酵母安全可靠，可用于食品、医药等众多行业；菌株生长速度快，抗逆性强，培养简单，适合工业化；分子操作平台成熟且遗传工具完善，发展前景广阔。雨生红球藻( h. pluvialis)是公认的在自然界中生产天然虾青素的最理想来源，虾青素是一种天然抗氧化剂，是迄今为止发现的抗氧化能力最强的抗氧化剂，其抗氧化能力是天然β-胡萝卜素的10倍，是维生素e的550倍。在巴斯德毕赤酵母中引入外源β-类胡萝卜素合成模块和虾青素合成模块能够使其异源合成虾青素。现有技术已有对巴斯德毕赤酵母菌进行基因改造获得产与雨生红球藻相同构型的3s, 3s’虾青素的重组巴斯德毕赤酵母。在引入产物合成模块后所得的虾青素对细胞有一定毒害作用，虾青素产量增加的同时带来的细胞伤害也抑制了产量的进一步增长，使得虾青素产量无法进一步提高。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一株产虾青素的巴斯德毕赤酵母菌株。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株产虾青素的重组巴斯德毕赤酵母菌株，向巴斯德毕赤酵母( pichia  pastoris)中导入香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶thmgr、β-胡萝卜素酮醇酶crtw和β-胡萝卜素羟化酶crtz的表达盒得到；其中，所述crte、crtyb、crti的基因来源于红法夫酵母( xanthophyllomyces denrorhous)，所述thmgr的基因来源于酿酒酵母( saccharomyces cerevisiae)，所述crtw、crtz的基因来源于雨生红球藻( haematococcus  pluvialis)。

4、作为一种优选的实施方式，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母 gs115菌株。

5、作为一种优选的实施方式，所述crte、crtyb、crti、thmgr、crtw、crtz的编码基因序列分别如seq id no：1-6所示。

6、作为一种优选的实施方式，所述表达盒的启动子为巴斯德毕赤酵母的pgpm1启动子、ppdc1启动子、pmdh3启动子、padh2启动子、gap启动子或酿酒酵母的tef1启动子；所述表达盒的终止子为巴斯德毕赤酵母的sccyc1tt终止子、rpp1btt终止子、rps2tt终止子、rpl2att终止子、rps25att终止子或rps3tt终止子。

7、作为一种优选的实施方式，所述重组巴斯德毕赤酵母还表达1个标记基因；所述标记基因选自质粒bb3rn-ag的诺尔丝菌素编码基因表达盒。

8、本发明的另一目的在于提供上述重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，将所述crte、crtyb、crti、thmgr、crtw以及crtz的表达盒通过质粒形式导入所述巴斯德毕赤酵母菌株，整合在巴斯德毕赤酵母菌株基因组上；

9、其中，所述crtw和crtz分别插入载体质粒或通过linker连接后插入载体质粒；

10、所述linker的氨基酸序列为gggggggg。

11、作为一种优选的实施方式，所述构建方法包括：将所述crte、crtyb、crti、thmgr的基因片段分别通过goldengate方法插入质粒bb1-23中，将crtw和crtz的基因片段分别通过goldengate方法插入质粒bb1-23中，或用linker连接后通过goldengate方法插入质粒bb1-23中，获得重组质粒bb1-23-crte、bb1-23-crtyb、bb1-23-crti、bb1-23-thmgr，以及bb1-23-crtw、bb1-23-crtz或bb1-23-crtw-l-crtz；

12、将所述重组质粒通过goldengate方法分别连接启动子和终止子，获得连接启动子和终止子的重组质粒，其中，crti的启动子为pgpm1，终止子为sccyc1tt，crte的启动子为ppdc1启动子，终止子为rpp1btt，crtyb的启动子为pmdh3，终止子为rps2tt，thmgr的启动子为padh2，终止子为rpl2att，crtw的启动子为ptef1，终止子为idp1tt，crtz的启动子为pgap，终止子为rps25att，crtw-l-crtz启动子为pgap，终止子为rps25att；

13、将所述连接启动子和终止子的重组质粒通过goldengate方法导入同一载体质粒，将整合了所有基因片段的重组质粒导入巴斯德毕赤酵母，获取重组巴斯德毕赤酵母菌株。

14、具体的，所述连接启动子和终止子的重组质粒和整合了所有基因片段的重组质粒的构建方法如下：

15、将所述质粒bb1-23-crti与质粒bb1-12-pgpm1、质粒bb1-34-sccyc1tt通过goldengate方法插入质粒bb2-ab中，得到质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt；

16、将所述质粒bb1-23-crte与质粒bb1-12-ppdc1、质粒bb1-34-rpp1btt通过goldengate方法插入质粒bb2-bc中，得到质粒bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt；

17、将所述质粒bb1-23-crtyb与质粒bb1-12-pmdh3、质粒bb1-34-rps2tt通过goldengate方法插入质粒bb2-cd中，得到质粒bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt；

18、将所述质粒bb1-23-thmgr与质粒bb1-12-padh2、质粒bb1-34-rpl2att通过goldengate方法插入质粒bb2-de中，得到质粒bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att；

19、将所述质粒bb1-23-crtw与质粒bb1-12-ptef1、质粒bb1-34-idp1tt通过goldengate方法插入质粒bb2-ef中，得到质粒bb2-ef-ptef1-crtw-idp1tt；

20、将所述质粒bb1-23-crtz与质粒bb1-12-pgap、质粒bb1-34-rps25att通过goldengate方法插入质粒bb2-fg中，得到质粒bb2-fg-pgap-crtz-rps25att；

21、或将所述质粒bb1-23-crtw-l-crtz与质粒bb1-12-pgap、质粒bb1-34-rps25att通过goldengate方法插入质粒bb2-ef中，得到质粒bb2-ef-pgap-crtw-l-crtz-rps25att；

22、将所述重组质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att、bb2-ef-ptef1-crtw-idp1tt和bb2-fg-pgap-crtz-rps25att通过goldengate方法插入质粒bb3rn-ag中，得到质粒bb3rn-ag-crtieybwzthmgr；

23、或将所述重组质粒b2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att和bb2-ef-pgap-crtw-l-crtz-rps25att通过goldengate方法插入质粒bb3rn-af中，得到质粒bb3rn-af-crtieybtw-l-z；

24、将所述重组质粒bb3rn-ag-crtieybwzthmgr或bb3rn-af-crtieybtw-l-z导入巴斯德毕赤酵母，获取重组巴斯德毕赤酵母菌株。

25、本发明的再一目的是提供上述重组巴斯德毕赤酵母在生产虾青素中的应用。包括：

26、将上述重组巴斯德毕赤酵母接种于ypd培养基平板上，在30℃下活化培养24 h；

27、将经活化的巴斯德毕赤酵母的单菌落接种于ypd试管中，摇床震荡培养24 h；然后进行250 ml摇瓶发酵培养。

28、作为一种优选的实施方式，将所述重组巴斯德毕赤酵母利用以5-30 g/l葡萄糖或甘油为唯一碳源的培养基培养20-30 h后，加入甲醇发酵4-6 d。进一步优选为，将所述重组巴斯德毕赤酵母先利用以20-30 g/l甘油为唯一碳源的培养基培养20-30 h后，加入甲醇发酵。

29、本发明的重组巴斯德毕赤酵母能够发酵生产虾青素，实现了天然产物虾青素在巴斯德毕赤酵母中的高效合成。此外，本技术利用双底物分步培养工艺，大大提高了以甲醇为唯一碳源发酵时重组巴斯德毕赤酵母的虾青素产量，对高价值萜类产物的工业化以及商业化应用具有重大的现实意义和经济价值。