一种双水相体系环介导等温扩增检测核酸的方法

本发明属于分析检测，具体涉及一种双水相体系环介导等温扩增检测核酸的方法。

背景技术：

1、由病原体的快速广泛传播引发的流行病如covid-19、h1n1等在世界范围内造成了数百万人的死亡和经济衰退。考虑到全球快速扩张和不断上升的死亡人数，征服流行病最重要的是在早期阶段迅速诊断疾病，特别是在有病症出现之前的阶段，这有利于医疗团队有效地管理病人，也有利于决策者在流行病仍然可以控制的情况下遏制病原体的传播。

2、在目前的疾病检测工具中，核酸扩增试验尤其是环介导等温核酸扩增技术(lamp)脱颖而出，由于其结果具有一致性和可靠性，成为临床诊断的重要方法，更重要的是lamp能够检测到从样本中分离出来的少量目标病原体核酸分子，使其有可能在感染的早期阶段进行诊断。然而，检测少量的目标核酸分子时，会延长lamp的检测时间，并极大增加产生假阳性结果的机会。这是因为目标核酸分子在lamp检测体系中是随机分散的，其极低的浓度大幅减缓了扩增反应速度，并易引发非特异性扩增导致假阳性结果。因此，在目标核酸分子浓度较低时，lamp反应难以对目标核酸分子进行快速和准确的检测，最终易导致包括延迟治疗、不必要诊断等严重后果，并使决策者误判流行病的整体情况。

3、为快速、准确地进行lamp反应以助力流行病的早期诊断，提高lamp反应效率，最常用的方法是用纳米粒子、磁珠等固体载体富集lamp反应体系中随机分散的目标核酸，以提高目标核酸的浓度，加快扩增速度。例如，公开号为cn117025838a (申请号为cn202310651861.5)的中国专利公开了一种基于靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法：利用sars-cov-2核酸序列，设计针对3个靶区域的生物素/氨基化核酸探针，与亲和素/羧基化纳米磁珠偶联，构建了特异性核酸富集的功能化纳米磁珠，并缩短了核酸检测的时间，使ct值(循环阈值，反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数)提前了5～6。国内外也进行了很多相关研究。如juewen liu等人使用金纳米粒子通过化学共价键将核酸充分吸附并加速lamp扩增(jiang x,yang m,liu j.capping gold nanoparticles toachieve a protein-like surface for loop-mediated isothermal amplificationacceleration and ultrasensitive dna detection.acs appl mater interfaces.2022；14(24):27666-27674.)，使lamp检测时间提前了16min。因此，采用此种策略，由于核酸和固体粒子的物理结合是不稳定的，化学共价键也会影响核酸分子的结构(an h,jinb.prospects of nanoparticle-dna binding and its implications in medicalbiotechnology.biotechnology advances.2012；30(6):1721-1732.)，最终导致它们对反应的加速效果并不理想，只加速了10几分钟。还有研究通过加入额外的引物来加速lamp反应。例如，公开号为cn113234854a(申请号为cn202110401358.5)的中国专利公开了一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒，通过设计与现有引物序列不同的内引物fip和bip、外引物f3和b3，并加入了2条成环引物loopf和loopb，使等温扩增时间缩短了一半；xiaofei he等人通过加入一对内引物，生成更多的茎环dna来加速lamp反应(he x,su f,chen y,li z.novel reverse transcription-multiple inner primerloop-mediated isothermal amplification(rt-miplamp)for visual and sensitivedetection of sars-cov-2.analytical methods.2022；14(47):5012-5018.)，使反应提前了25min，但加入额外的引物势必会引起非特异性扩增，且此种方法灵敏度普遍不高，检测限最低为103copies/μl。

技术实现思路

1、为了解决上述不足，本发明提供一种双水相体系环介导等温扩增检测核酸的方法。

2、本发明的一种双水相体系环介导等温扩增检测核酸的方法，包括以下步骤：

3、步骤1：双水相的制备：电子天平称取聚乙二醇和葡聚糖粉末，加入去离子水中，形成混合物水溶液，搅拌并静置至溶液变得清澈透明，形成两相分离完全的聚乙二醇/葡聚糖双水相溶液。

4、步骤2：制备环介导等温扩增反应物，包括：4.5～6.5μl核酸扩增反应液(mg2+、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、甜菜碱和dntps)、0.5～1μl引物、0.5～1μl bst聚合酶、0.25～0.5μl syto-9、1μl核酸模板。

5、步骤3：在双水相/去离子水体系中进行环介导等温扩增反应：将步骤2的扩增反应物加入pcr管1中，先后抽取步骤1中的聚乙二醇/葡聚糖双水相各4～6μl加入pcr管1中；将步骤2的扩增反应物加入pcr管2中，取4～6μl去离子水加入pcr管2；之后将pcr管全部放入pcr仪。

6、进一步的，步骤1中聚乙二醇分子量为2～8kda，葡聚糖分子量为20～500kda。

7、进一步的，步骤1中溶液在磁力搅拌器以300rpm的速度搅拌4～12h至完全溶解。

8、进一步的，步骤1中溶液搅拌后静置12～24h至两相清澈透明并完全分离。

9、进一步的，步骤1中聚乙二醇/葡聚糖双水相溶液的质量浓度为4～16％。

10、进一步的，步骤3中pcr管离心或静置30～90min。

11、进一步的，步骤3中pcr管放入7500q-pcr仪中，在63℃下反应120min。

12、本发明的有益技术效果为：

13、(1)本发明基于双水相体系富集效应加速lamp反应，步骤简单，全过程绿色温和，不会影响核酸的结构稳定性和功能，在不损害反应灵敏度的前提下，相较于传统的等温扩增反应体系，即在去离子水中，双水相通过富集扩增重要的反应物，使核酸扩增反应时间提前了27min。

14、(2)本发明提出的双水相核酸扩增体系具有较高的灵敏度，在双水相中，当核酸浓度低至10copies/μl时，仍可以检测到荧光信号，检测限低。

15、(3)本发明提出的双水相核酸扩增体系中，核酸浓度与扩增反应的ct值之间呈良好的线性关系，r2＝0.992，这有助于后续对未知浓度的核酸样本进行定量分析。

16、(4)本发明在实验过程中，可以通过改变双水相的浓度实现对lamp反应速率的调控

17、(5)本发明采用温和简便的方法有效提高了lamp的反应效率，可造福于分析诊断等领域。