一种用于检测人乳头瘤病毒的组合物、检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子学生物检测，具体涉及一种用于检测人乳头瘤病毒的组合物、检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，几乎100%的宫颈癌由人乳头状瘤病毒（hpv）感染引起。

2、人乳头瘤病毒（human papillomavirus, hpv）是一种常见的嗜上皮细胞病毒，其基因组为双股环状dna，长8000bp，主要编码8个开放阅读框，分为早期转录区、晚期转录区和非转录区。国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，iarc）将hpv部分亚型依据其诱发宫颈癌的风险划分为高危hpv亚型（high-risk hpv, hr-hpv）和低危hpv亚型（low-risk hpv, lr-hpv）。高危及低危hpv亚型的感染均可引起人体上皮细胞的鳞状增生。hr-hpv与宫颈癌、肛管癌、阴茎癌、口咽部癌等肿瘤的发生密切相关；lr-hpv感染可诱发寻常疣、生殖器疣等皮肤与黏膜系统疾病。在已发现的 hr-hpv中，hpv-16型和hpv-18型是引发宫颈癌最常见的亚型，其分型检测也是宫颈癌筛查过程中重要分流依据；外生殖道感染诊断出的lr-hpv中，hpv-6型和hpv-11型最为常见。依据who国际癌症研究机构（iarc）及其他国际组织的研究成果，将hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别。将hpv26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别，低危型hpv如6、11、42、43、44型。hpv感染宫颈上皮后，因其基因型别不同、是否持续感染及持续感染时间不同，其致病风险也显著不同。因此，对hpv进行分型检测并明确是否存在持续感染具有重要的临床意义。

3、目前我国临床检测hpv感染的方法有液相杂交捕获和实时荧光pcr法。其中实时荧光pcr法又以其灵敏度高、操作简单且不易造成污染等优势成为当今检测方法的大趋势。中国专利cn110592279a 公布了一种检测hpv的组合物、试剂盒及方法，其能够对hpv16/18分型，同时检出其它13种高危型hpv型别，灵敏度为1000copies/ml，但其不包括中危型。专利cn102229930a公布了一种pcr组以及人乳头瘤病毒检测方法与试剂盒，其可以同时对18种hpv型别同时进行检测，但无法对hpv16/18进行区分鉴定，无法达到hpv16/18宫颈癌检测分流的效果。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的组合物、检测方法及试剂盒。本发明针对hpv 16/18型别单独设计特异性引物探针，实现对这两个型别的鉴定，同时设计了能检测出其它16种hpv型别（包含低危型）的引物探针组合。

2、为解决背景技术中提出的技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明中提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的组合物，所述组合物中包括：

4、18型hpv的上游引物和下游引物，以及对应的探针；所述18型hpv包括：hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82型；

5、其中，各型hpv对应的探针均连接有荧光报告基团；所述hpv16型探针连接的荧光报告基团和所述hpv18型探针连接的荧光报告基团不相同，且所述hpv16型探针和所述hpv18型探针连接的荧光报告基团与其余探针连接的荧光报告基团也不相同。

6、可选地，所述组合物包括下列引物和探针：

7、如seq id no:1所示的hpv16型上游引物、如seq id no:3所示的hpv16型下游引物、如seq id no:2所示的hpv16型探针；

8、如seq id no:4所示的hpv18型上游引物、如seq id no:6所示的hpv18型下游引物、如seq id no:5所示的hpv18型探针；

9、如seq id no:7所示的hpv31型上游引物、如seq id no:9所示的hpv31型下游引物、如seq id no:8所示的hpv31型探针；

10、如seq id no:10所示的hpv33型上游引物、如seq id no:12所示的hpv33型下游引物、如seq id no:11所示的hpv33型探针；

11、如seq id no:13所示的hpv35型上游引物、如seq id no:15所示的hpv35型下游引物、如seq id no:14所示的hpv35型探针；

12、如seq id no:16所示的hpv39型上游引物、如seq id no:18所示的hpv39型下游引物、如seq id no:17所示的hpv39型探针；

13、如seq id no:19所示的hpv45型上游引物、如seq id no:21所示的hpv45型下游引物、如seq id no:20所示的hpv45型探针；

14、如seq id no:22所示的hpv51型上游引物、如seq id no:24所示的hpv51型下游引物、如seq id no:23所示的hpv51型探针；

15、如seq id no:25所示的hpv52型上游引物、如seq id no:27所示的hpv52型下游引物、如seq id no:26所示的hpv52型探针；

16、如seq id no:28所示的hpv56型上游引物、如seq id no:30所示的hpv56型下游引物、如seq id no:29所示的hpv56型探针；

17、如seq id no:31所示的hpv58型上游引物、如seq id no:33所示的hpv58型下游引物、如seq id no:32所示的hpv58型探针；

18、如seq id no:34所示的hpv59型上游引物、如seq id no:36所示的hpv59型下游引物、如seq id no:35所示的hpv59型探针；

19、如seq id no:37所示的hpv68型上游引物、如seq id no:39所示的hpv68型下游引物、如seq id no:38所示的hpv68型探针；

20、如seq id no:40所示的hpv26型上游引物、如seq id no:42所示的hpv26型下游引物、如seq id no:41所示的hpv26型探针；

21、如seq id no:43所示的hpv53型上游引物、如seq id no:45所示的hpv53型下游引物、如seq id no:44所示的hpv53型探针；

22、如seq id no:46所示的hpv66型上游引物、如seq id no:48所示的hpv66型下游引物、如seq id no:47所示的hpv66型探针；

23、如seq id no:49所示的hpv73型上游引物、如seq id no:51所示的hpv73型下游引物、如seq id no:50所示的hpv73型探针；

24、如seq id no:52所示的hpv82型上游引物、如seq id no:54所示的hpv82型下游引物、如seq id no:53所示的hpv82型探针。

25、可选地，所述hpv16型探针连接的荧光报告基团为fam；所述hpv18型探针连接的荧光报告基团为vic；所述hpv31型探针、hpv33型探针、hpv35型探针、hpv39型探针、hpv45型探针、hpv51型探针、hpv52型探针、hpv56型探针、hpv58型探针、hpv59型探针、hpv68型探针、hpv26型探针、hpv53型探针、hpv66型探针、hpv73型探针和hpv82型探针连接的荧光报告基团均为rox。

26、可选地，各探针还连接有荧光淬灭基团；所述hpv16型探针连接的荧光淬灭基团为mgb；所述hpv18型探针连接的荧光淬灭基团为bhq1；所述hpv31型探针、hpv33型探针、hpv35型探针、hpv39型探针、hpv45型探针、hpv51型探针、hpv52型探针、hpv56型探针、hpv58型探针、hpv59型探针、hpv68型探针、hpv26型探针、hpv53型探针、hpv66型探针、hpv73型探针和hpv82型探针连接的荧光淬灭基团均为bhq2。

27、可选地，所述组合物中还包括：如seq id no:55和seq id no:57所示的内标引物组，以及如seq id no:56所示的内标探针。

28、可选地，所述内标探针的两端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；所述内标探针连接的荧光报告基团为cy5，所述内标探针连接的荧光淬灭基团为bhq3。

29、可选地，所述组合物中各引物的浓度为0.05~0.5μmol/l，所述组合物中各探针的浓度为0.025~0.2μmol/l。

30、第二方面，本发明提供了如上所述的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的用途，所述hpv为hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82型。

31、第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。

32、可选地，所述试剂盒包括：提取dna所需试剂、mg2+、dntps、dna聚合酶和pcr缓冲液。

33、第四方面，本发明提供了一种用于检测hpv的方法，所述方法包括以下步骤：

34、提取待测样本的dna；

35、使用如上所述的组合物或如上所述的试剂盒对步骤1)获得的dna进行荧光定量pcr；

36、获得并分析结果。

37、可选地，所述荧光定量pcr是两步法pcr，包括90~97℃下10~20s的变性步骤和55~65℃下20~40s的退火及延伸步骤，反应进行35~45个循环。

38、本发明的上述技术方案的有益效果如下：

39、本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的组合物、检测方法及试剂盒，所述组合物中包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82型的上游引物和下游引物，以及对应的探针。其中所述hpv16型探针连接的荧光报告基团和所述hpv18型探针连接的荧光报告基团不相同，且所述hpv16型探针和所述hpv18型探针连接的荧光报告基团与其余探针连接的荧光报告基团也不相同。

40、本发明提供的组合物及试剂盒至少具有以下优点：

41、（1）本发明中设计特异性引物探针组合，能够同时完成hpv16/18分型及其它16种型别的检出，精准检测与分型，可防止漏检，各个型别之间无交叉反应且无漏检情况，且灵敏度高（200copies/ml）。

42、（2）采用多重扩增技术可在一管内实现16/18型和其它16种中hpv型别的检测，多重检测实现高效，且可节约一定的试剂成本。

43、（3）全程闭管检测，一管完成分型检测，简单便捷，且可避免实验结果和实验室的环境的污染。