核酸适配体、传感器、检测试剂盒及其在检测四氢叶酸中的应用

本发明涉及核酸适配体，尤其涉及特异识别四氢叶酸的核酸适配体以及含有该核酸适配体的传感器、检测探针或检测试剂盒及其在检测四氢叶酸中的应用，属于核酸适配体及其应用领域。

背景技术：

1、四氢叶酸（thf)是叶酸在体内的活性形态之一，是一碳基团转移酶的辅酶，具有传递一碳基团的作用，是许多生物合成反应所必需的辅酶。若生物体内缺乏四氢叶酸，会使多种生物合成反应受阻，最典型的表现为血红细胞的发育和成熟受到影响，易发生巨幼红细胞性贫血症等。因此，在生物组织中监测thf，对早期疾病的发生有重要作用。

2、目前，检测叶酸及其活性形态的主要检测方法是采用高效液相质谱（hplc-ms）法，联用技术基于高效液相质谱法检测，但是其成本高，操作复杂，很大程度限制了其在检测行业的广泛应用。市场上销售的快速检测试剂盒，多针对叶酸受体进行检测，几乎未见针对叶酸或者四氢叶酸直接检测的试剂盒。鉴于目前四氢叶酸检测难度大、成本高等问题，因此，发展一种新型识别分子，对生物样品中四氢叶酸含量测定具有重要的实践意义，可进一步开发四氢叶酸快速检测方法，如试剂盒等。

3、核酸适配体（aptamer）是一种新型识别分子，近几年来得到广泛关注。核酸适配体能通过折叠成二级或三级结构，与靶标分子以氢键作用和形状匹配等作用方式高效结合，靶标包括，小分子、抗生素、蛋白、金属离子等。具有亲和力高，特异性好，易合成等优点，是一种理想的识别分子，可广泛应用于分析检测领域。

4、迄今为止，未有特异性识别四氢叶酸核酸适配体的研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供特异性识别四氢叶酸的核酸适配体；

2、本发明的目的之二是提供含有所述特异性识别四氢叶酸的核酸适配体的传感器或检测试剂盒；

3、本发明的目的之三将所述的识别四氢叶酸的核酸适配体应用于检测生物样品中的四氢叶酸。

4、为实现上述的目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

5、本发明的一方面是提供识别四氢叶酸的核酸适配体，所述的核酸适配体选自以下(a)-(d)所述的任何一种多核苷酸序列：

6、(a)seq id no.1所示的多核苷酸序列；

7、或(b)与seq id no.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；

8、或(c)由seq id no.1所示的多核苷酸序列转录的rna序列；

9、或(d)与seq id no.1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；优选的，与seqid no.1的多核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；更优选的，与seq id no.1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸。

10、本发明的一种优选的具体实施方案，所述核酸适配体的核苷酸序列可被修饰，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化修饰；或者，所述核酸适配体的序列的5’端或3’端连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶等。

11、本发明的另一方面是提供一种检测四氢叶酸的核酸适配体传感器，该核酸适配体传感器包括pcr引物、特异结合四氢叶酸的核酸适配体；所述的特异结合四氢叶酸的核酸适配体是本发明所筛选得到的核酸适配体，其中，在所述的核酸适配体的5’端或3’端修饰荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶等。

12、本发明的再一方面是一种检测四氢叶酸的试剂盒，该试剂盒包括：pcr管修饰溶液，pcr体系溶液，特异结合四氢叶酸的核酸适配体；其中，上述的特异结合四氢叶酸的核酸适配体的多核苷酸序列为seq id no.1所示；所述的pcr体系溶液可以为商购dna聚合酶时所带的反应液，也可以为根据反应原理配制而成的反应液，其中包括以下组分：sybr green染料，taq dna 聚合酶，pcr缓冲液，dntp和水。

13、本发明利用指数级富集配体的系统进化技术(selex)，以磁珠为分离介质，以四氢叶酸（thf）为靶标，通过9轮筛选获得与靶标特异结合的适配体，亲和力极高，解离常数达到μm,，能特异性结合thf小分子；本发明所筛选获得的核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，成本低、生产周期短，易于化学修饰，可将该适配体制备成传感器、分子探针或检测试剂等用于食品中thf小分子的快速检测。

14、本发明所涉及到的术语定义

15、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

16、术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85%或更高，更优选地90%或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

17、术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

18、术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍）。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（tijssen, techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic probes, "overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点（tm）约5-10℃。tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、ph和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在ph 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 m钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×ssc和1% sds，在42℃下培养；或5×ssc，1% sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1% sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。