一种烟酰胺核糖激酶突变体在大肠杆菌中的高效异源表达及其应用的制作方法

本发明属于酶工程。更具体地，涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体在大肠杆菌中的高效异源表达及其应用。

背景技术：

1、β-烟酰胺单核苷酸(β-nmn)是广泛存在于人类和动物体内的一种生物活性核苷酸。作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的直接前体，β-nmn对提高体内nad+水平具有显著作用，在预防和改善衰老相关的症状和慢性疾病方面具有重要应用，可开发为膳食补充剂或护肤品等。但当前β-nmn的产量并不能满足其日益增长的需求。

2、2010年以前，β-nmn主要以单磷酸腺苷(amp)、四乙酰核糖(tar)和烟酰胺(nam)为原料，通过化学合成的方式大规模生产。但由于有机溶剂的使用量增加、环境污染和纯化等难题，这种方法最终被终止。结合生物催化和微生物代谢工程生物合成β-nmn具有绿色、环保的优点。随着对β-nmn代谢途径的分析以及代谢和酶工程技术的发展，生物催化已成为大规模生产β-nmn的主要方法。

3、通过大肠杆菌代谢工程方法合成nmn通常是以烟酰胺(nam)和磷酸戊糖途径的中间体磷酸核糖基焦磷酸(prpp)作为底物，经过磷酸核糖糖基转移酶(nampt，ec 2.4.2.12)催化生成。但是以葡萄糖、木糖作为原料很难达到细胞内prpp的高水平积累，最终导致nmn的产量并不理想。另一种nmn的生物合成方法是以烟酰胺核糖(nr)和atp作为底物，经过烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase，nrk)催化生成β-nmn。但现有nrk在大肠杆菌等宿主菌中异源表达后的酶活力普遍不高，通过高密度发酵工艺等所得发酵液中的烟酰胺核糖激酶酶活也仅在100u/ml左右，仍不能很好的满足酶法高效合成β-nmn的需要。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种能够在大肠杆菌中表达的烟酰胺核糖激酶，同时还提供了酶活相对亲本提高的烟酰胺核糖激酶的突变体，以及高效异源表达烟酰胺核糖激酶的方法和应用，有利于β-烟酰胺单核苷酸的高效生物合成。

2、本发明的第一个目的是提供一种烟酰胺核糖激酶。

3、本发明的第二个目的是提供一种编码所述烟酰胺核糖激酶的基因。

4、本发明的第三个目的是提供所述烟酰胺核糖激酶的突变体。

5、本发明的第四个目的是提供一种编码所述突变体的基因。

6、本发明的第五个目的是提供一种表达烟酰胺核糖激酶的重组质粒。

7、本发明的第六个目的是提供一种含有所述重组质粒的重组菌。

8、本发明的第七个目的是提供一种提高烟酰胺核糖激酶酶活力的方法。

9、本发明的第八个目的是提供一种高效异源表达烟酰胺核糖激酶的方法。

10、本发明的第九个目的是提供所述烟酰胺核糖激酶、所述基因、所述突变体、所述重组质粒或所述重组菌在生物合成β-烟酰胺单核苷酸或在制备用于生物合成β-烟酰胺单核苷酸的产品中的应用。

11、本发明的第十个目的是提供一种生物合成β-烟酰胺单核苷酸的方法。

12、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

13、本发明提供了一种烟酰胺核糖激酶，所述烟酰胺核糖激酶可以在大肠杆菌中表达，所述烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

14、本发明还提供了编码所述烟酰胺核糖激酶的基因。

15、作为其中的一种可选实施方式，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

16、本发明还提供了一种表达所述烟酰胺核糖激酶的重组质粒，构建所述重组质粒所用载体为pet-28a、pet-32a、prsfduet-1或pet-3b。

17、优选地，构建所述重组质粒所用载体为prsfduet-1，利用该载体构建得到的重组质粒转化宿主菌后，所得重组菌表达所得的烟酰胺核糖激酶的酶活力相对更高。

18、本发明还提供了所述烟酰胺核糖激酶的突变体，所述突变体是对seq id no.2所示烟酰胺核糖激酶的第45、88或189位氨基酸中的任意一个或几个氨基酸进行突变得到。

19、具体地，所述突变为：

20、将第45位天冬氨酸(d)突变为甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)中的任意一种；

21、将第88位异亮氨酸(i)突变为甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、精氨酸(r)、组氨酸(h)中的任意一种；

22、将第189位谷氨酸(e)突变为甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、谷氨酰胺(q)中的任意一种；

23、或将第45、88和189位分别突变为苏氨酸(t)、精氨酸(r)和丙氨酸(a)。

24、如上，各突变体的具体氨基酸序列不再列出。

25、另编码所述突变体的基因序列也不再列出。在氨基酸序列已知以及编码亲本烟酰胺核糖激酶的基因序列已知的基础上，按本领域公知氨基酸与碱基的密码子对应关系即可确定编码所述突变体的基因序列。除对亲本进行突变外，也可以依据突变体的序列，通过人工合成等方法获得相应突变体。因此，本发明请求保护编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的基因。利用所述基因，可通过重组表达获得相应的突变体。

26、本发明还提供了一种表达烟酰胺核糖激酶的重组质粒。

27、具体地，所述重组质粒中含有编码本发明所述烟酰胺核糖激酶或其突变体的基因；或在含有编码本发明所述突变体的基因的基础上，在所述重组质粒的原有启动子序列与所述基因间还含有核糖体结合位点序列和/或其它启动子序列；所述核糖体结合位点序列如seq id no.12或seq id no.13所示，所述其它启动子序列如seq id no.17或seq idno.21所示。

28、可选地，构建所述重组质粒所用载体为pet-28a、pet-32a、prsfduet-1或pet-3b。

29、优选地，构建所述重组质粒所用载体为prsfduet-1。

30、本发明还提供了一种含有上述重组质粒的重组菌。

31、可选地，所述重组菌是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母为出发菌株。

32、在本发明具体的实施例中是以大肠杆菌为出发菌株。

33、本发明还提供了一种提高烟酰胺核糖激酶酶活力的方法，所述方法为：对本发明所述烟酰胺核糖激酶的第45、88或189位氨基酸中的任意一个或几个氨基酸进行突变；

34、或将编码本发明所述烟酰胺核糖激酶的基因序列替换为编码本发明所述烟酰胺核糖激酶突变体的基因序列。

35、本发明还提供了一种高效异源表达烟酰胺核糖激酶的方法，所述方法为：在构建用于表达本发明所述烟酰胺核糖激酶或所述烟酰胺核糖激酶的突变体的重组质粒时，对重组质粒进行如下改造：在重组质粒的原有启动子序列与基因序列之间插入核糖体结合位点序列和/或其它启动子序列；所述核糖体结合位点序列如seq id no.12或seq id no.13所示，所述其它启动子序列如seq id no.17或seq id no.21所示。

36、seq id no.12或seq id no.13所示的核糖体结合位点序列和/或seq id no.17或seq id no.21所示启动子序列在提高本发明所述烟酰胺核糖激酶的酶活(或说异源表达)中的应用也应在本发明的保护范围之内。

37、本发明还请求保护所述烟酰胺核糖激酶、编码所述烟酰胺核糖激酶的基因、所述烟酰胺核糖激酶的突变体、编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的基因、所述重组质粒或所述重组菌在生物合成β-烟酰胺单核苷酸或在制备用于生物合成β-烟酰胺单核苷酸的产品中的应用。

38、本发明还提供了一种生物合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法为：将生物合成β-烟酰胺单核苷酸所用烟酰胺核糖激酶替换为本发明所述烟酰胺核糖激酶的突变体，或将所用表达烟酰胺核糖激酶的重组菌替换为本发明所述重组菌。

39、具体地，所述方法为：以烟酰胺核糖(nr)和atp作为底物，用本发明所述烟酰胺核糖激酶的突变体或所述重组菌催化合成β-烟酰胺单核苷酸。

40、作为其中一种具体的实施方式，所述方法为：活化本发明所述重组菌，得种子液；将所得种子液接入发酵罐中，35～37℃培养至od600达到28～32时，降温至24～26℃并加入终浓度为0.4～0.6mm的iptg诱导表达10～12h后进行补料发酵；补料发酵过程中，控制培养体系ph为6.5～7.5，控制发酵罐转速为350～450rpm；随着菌体的不断生长，葡萄糖被逐步消耗，当其浓度低于2g/l时，进行流加补料，利用其催化底物生成β-烟酰胺单核苷酸。

41、具体地，所述方法为：活化本发明所述重组菌，得种子液；将所得种子液以7.5％(v/v)的接种量接入发酵罐培养基中，37℃培养至od600达到30时，降温至25℃，加入0.5mm的iptg诱导表达12h后进行补料发酵；在补料发酵过程中，控制培养体系ph为7.0，控制发酵罐转速为400rpm；当葡萄糖浓度低于2g/l时，进行流加补料，利用所述重组菌催化底物生成β-烟酰胺单核苷酸。

42、此外，利用本发明所述重组菌进行全细胞催化时，当检测到第一批底物耗尽时，加入第二批底物，以此类推；加入第三批底物时，β-烟酰胺单核苷酸的产量最高。

43、本发明具有以下有益效果：

44、本发明提供了一种能够在大肠杆菌中异源表达的烟酰胺核糖激酶，同时还提供了所述烟酰胺核糖激酶的突变体，所述突变体的烟酰胺核糖激酶活性相对亲本有了明显提升。在所述烟酰胺核糖激酶及其突变体的基础上，本发明还提供了一种高效异源表达烟酰胺核糖激酶的方法，即在构建重组质粒时，通过在质粒中引入核糖体结合位点、插入特定的启动子序列等，使表达所得烟酰胺核糖激酶的酶活力较对照更高。此外，本发明还提供了扩大培养表达所述烟酰胺核糖激酶的重组菌的方法，使其表达所得的烟酰胺核糖激酶酶活进一步提高，最高为208.3u/ml。

45、本发明有利于β-烟酰胺单核苷酸的高效生物合成，适合工业化生产和应用。