一种固定化酶高效制备α-熊果苷的方法

本发明属于生物合成，尤其涉及一种固定化酶高效制备α-熊果苷的方法。

背景技术：

1、熊果苷（arbutin）是一种对苯二酚糖基化产物，天然存在于浆果、桑葚、蔓越莓、梨和小麦中。熊果苷作为化妆品添加剂可以减少皮肤黑色素的产生，从而减少黄褐斑或晒伤患者的过度皮肤色素沉着，因此熊果苷可以作为一种天然的皮肤增白剂，在制药和化妆品行业中需求量很大。20世纪90年代由日本资生堂作为化妆品美白剂首先推出，目前发达国家广泛使用熊果苷作为美白产品添加剂。

2、熊果苷根据构型的不同可以分为α-熊果苷和β-熊果苷，它们作为皮肤增白剂的作用机理不同：α-熊果苷是通过对酪氨酸酶的竞争性抑制作用减少黑色素的生成；而β-熊果苷是通过减少酪氨酸酶基因的表达或减少细胞分裂从而减少黑色素生成。α-熊果苷对酪氨酸的抑制能力是β-熊果苷的10倍，且β-熊果苷的添加量超过3%会对人体细胞产生抑制，从而导致黑素细胞衰退，皮肤屏障受损。因此目前α-熊果苷需求量更大。

3、α-熊果苷的制备方法主要包括微生物转化法、化学合成法和酶合成法。微生物转化法是利用生物体内的糖基化酶将外源的氢醌转化为α-熊果苷，该方法反应收率较高，但合成的产物夹杂细胞裂解物等杂质，后期纯化困难；化学合成法合成过程过于繁琐，而且产物多为β-熊果苷；酶合成法主要是利用糖苷酶或糖基转移酶将蔗糖或葡萄糖分解产生的葡萄糖基团转移至氢醌来合成α-熊果苷。酶合成法相较于化学合成法的优点是条件温和、反应迅速以及产物单一。

4、淀粉蔗糖酶（asase）催化合成α-熊果苷有较高的效率，目前使用较为广泛，asase属于gh13家族，可催化三类反应：水解反应，转糖苷反应和转糖基反应，其中转糖基作用应用最广。例如，从热水生栖息地的微生物中鉴定出的一种asase（asmet）其生产α-熊果苷的摩尔产率为70%。2017年，江南大学mu等发现来自 cellulomonas carboniz的asase（ccas）表现出显著的转葡糖基化活性，在不添加l-抗坏血酸的情况下，α-熊果苷的摩尔转化率达到45%。2019年，浙江工业大学chen等用 xanthomonas campestris来源的asase通过全细胞催化的方法生产α-熊果苷，摩尔转化率＞99%。2021年，印度生物资源与可持续发展研究所neera agarwal等利用 thermal springmetagenome来源的asase合成α-熊果苷，摩尔转化率达到75%。

5、全细胞催化法制备α-熊果苷具有催化效率高，成本低等优点，但受限于其催化方式，在催化过程中菌体破裂使得细胞内含物进入反应液中，会导致后期产物分离纯化困难。cn 114058660a公开了一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法，将固定化细胞装柱，组成固定化酶柱；(2)将双糖、氢醌溶于水中，混合料液调ph至酸性条件后流加入固定化酶柱中，与柱中固定化酶进行反应，收集流出液，即得。其将含蔗糖酶的细胞通过硅藻土等进行固定用于合成α-熊果苷，属于全细胞催化范畴。目前利用酶法制备α-熊果苷也较常用，但是酶合成法受限于生产成本高，酶与产物不易分离导致产物纯化困难。因此，为了降低成本，提高酶的利用率急需新的合成技术制备α-熊果苷。

6、

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种固定化酶合成α -熊果苷的方法，具有催化效率高、产物易于分离的特点。

2、为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

3、本发明提供了一种固定化酶高效合成α -熊果苷的方法，其包括如下步骤：

4、一种固定化酶高效合成α -熊果苷的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

5、s1：对氨基载体进行预处理

6、对氨基载体依次用ph 7.0磷酸缓冲液和5%戊二醛磷酸缓冲液置于25℃环境中活化处理，过滤抽干，冲洗；

7、s2：酶的固定化

8、称取氨基载体，在载体中加入淀粉蔗糖酶和ph6.0-9.0的缓冲液，将其置于摇床4℃孵育，孵育结束后弃去上清，并用 pbs 缓冲液（ph 7.0）洗涤，即得固定化酶；

9、s3：固定化酶酶促反应

10、将对苯二酚、蔗糖溶于ph为5.0-7.5pbs缓冲液中，加入5g固定化酶，于25~55℃反应10 min~30 min，反应液离心后即得。

11、作为本发明的一些优选实施方式，所述氨基载体选自lx-1000ea、lx-1000ha、lkz-128。

12、作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s2中氨基载体和淀粉蔗糖酶的质量比为1~2：0.006~0.050，所述氨基载体与所述缓冲液的质量体积比为4~6g：10~30ml。

13、作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s2中氨基载体和淀粉蔗糖酶的质量比为1：0.025，所述氨基载体与所述缓冲液的质量体积比为5g：20ml。

14、作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s3中对苯二酚、蔗糖和固化酶的质量比为1~3：16~30：50~200，所述固化酶与所述pbs缓冲液的质量体积比为1~10g：20~120ml。

15、作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s3中对苯二酚、蔗糖和固化酶的质量比为2：25：121，所述固化酶与所述pbs缓冲液的质量体积比为5g：80ml。

16、作为本发明的一些优选实施方式，步骤s3的反应温度为45℃。

17、作为本发明的一些优选实施方式，所述淀粉蔗糖酶为 cellulomonas carboniz来源的淀粉蔗糖酶。

18、作为本发明的一些优选实施方式，所述淀粉蔗糖酶的发酵方法如下：

19、取含有淀粉蔗糖酶基因的重组大肠杆菌菌液接种到含氨苄抗性的lb培养基中于37℃，180 rpm的摇床中过夜培养，标为种子液；

20、取种子液接种至10 l含氨苄抗性的tb培养基中，发酵程序设定为：温度37℃，ph7.0，转速范围100 rpm~300 rpm，开始发酵；当od600值达到6~8时，降温至30℃，加入 0.5 mmiptg诱导产生目的蛋白，同时开始补料，至10 h发 酵结束；将菌液离心后弃去培养基，收集菌体；

21、取30 g菌体加入300 ml的pbs缓冲液，充分混匀后用均质机对含有重组大肠杆菌细胞的菌液进行高压破壁，破壁后离心取上清；在低温下，加入终浓度10%硫酸铵，待其充分溶解后离心取上清；继续加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度达到50%，待其充分溶解后离心弃去上清，留取沉淀。

22、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

23、发明利用固定化酶技术制备α-熊果苷，以 cellulomonas carboniz来源的淀粉蔗糖酶（ccas）制备固定化酶。本发明以合成树脂为载体，以共价结合的方式进行固定化，从而增加酶的稳定性，使酶可重复利用，降低了生产成本，且固定化酶与产物易于分离，简化了产物的提纯。

24、本发明提供的方法，α-熊果苷的摩尔转化率最高可达95%以上，固化酶在连续使用12次之后的酶活保持在90%以上。