一种去除非目标核酸模板的方法与流程

本公开涉及生物，具体涉及一种去除非目标核酸模板的方法。

背景技术：

1、在pcr扩增过程中，pcr产物片段会通过气溶胶弥散在环境中，在进行第二次扩增实验，这些气溶胶的片段就会当成模板被扩增出来，最终会造成假阳性扩增的结果。

2、目前主要用来防止气溶胶污染的方法是dutp和udg酶(uracil dna glycosylase，尿嘧啶dna糖基酶)结合的方式，例如美国专利us7687247b1中公开的方法。但是，由于udg对du的切割，只是对一条链的切刻，在使用较低的dutp进行扩增产生的气溶胶，经过udg处理后仍然能被扩增出来。特别的是在tngs(targeted next generation sequencing，靶向下一代测序，例如病原微生物靶向测序)超多重pcr中，添加dutp的量不能太多，否则会影响多重扩增的性能，而添加较少的dutp会导致在tngs的多重扩增产物上du的比例较少，在udg进行切割之后的片段，会在扩增中通过正负链互搭的方式经过几轮pcr扩增会修复成一个完整的模板，从而导致气溶胶污染的模板被扩增出来。也就是说，udg酶并不能进行彻底清除含du的产物，增加udg酶的使用量仍然不能彻底清除。进而，我们在做tngs测序中，仍然能检测到来自气溶胶污染造成的假阳性的结果。因此当前的dutp结合udg酶的方法还不能真正地防止气溶胶污染。

技术实现思路

1、本公开的目的在于提供一种去除非目标核酸模板的方法，包括含有du/di/rx的引物介导的双链dna断裂法(简称mpdb)(图1)和含有du/di/rx的引物介导的双链dna外切法(简称mpde)(图2)。本公开提供的方法可以在不影响扩增的前提下，实现对非目标核酸模板(污染片段)的彻底清除的目的，并且，这种方法不仅可以应用到常规的pcr扩增和qpcr扩增中，还能够运用到tngs中的多重扩增中，保证每一次结果的保真性。

2、本公开的第一方面提供一种去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：向包含目标核酸模板和非目标核酸模板的反应体系中加入消化酶组合，并孵育；所述消化酶组合包括dna糖基化酶和ap位点内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有du(脱氧尿苷)或di(脱氧肌苷)中的至少一种，所述目标模板中不含有du或di；

3、或者，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有ra(腺嘌呤核糖核苷)，ru(尿嘧啶核糖核苷)，rg(鸟嘌呤核糖核苷)，rc(胞嘧啶核糖核苷)中的至少一种，所述目标核酸模板中不含有ra，ru，rg和rc。

4、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中仅含有di时，所述目标模板中不含有di，但可以含有或不含有du；当所述非目标核酸模板中仅含有du时，所述目标模板中不含有di，但可以含有或不含有di；当所述非目标核酸模板中仅含有du和di时，所述目标模板中不含有du或di。

5、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。

6、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。

7、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链核酸。在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链dna，所述双链dna至少部分互补。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链含有du或di，或，所述双链dna中至少一条链含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链的引物匹配位置含有du或di，或，所述双链dna中至少一条链的的引物匹配位置含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。

8、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板来自环境，例如气溶胶。

9、在一些实施方案中，所述反应体系是例如pcr扩增体系或等温扩增体系。

10、在一些实施方案中，所述dna糖基化酶特异性识别双链dna上的du或di位点并产生无嘌呤/无嘧啶位点(即ap位点)。

11、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil dnaglycosylase，udg酶)或单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand selective monofunctional uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特异性识别du位点并切除尿嘧啶(uracil，du)从而产生无嘧啶位点。

12、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine dna glycosylase，aag酶)或者内切酶ⅴ(endonuclease v)，所述aag酶或者内切酶ⅴ特异性识别di位点并切除次黄嘌呤(hypoxanthine，di)从而产生无嘌呤位点。

13、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du和di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶可以是分别识别du和di位点的两种酶，包括但不限于前述列举的dna糖基化酶的任意排列组合，例如udg酶和aag酶。

14、在一些实施方案中，ap位点是指无嘌呤/无嘧啶位点，缺刻位点是指损伤的核酸链上断裂一个磷酸二酯键，缺口是指损伤的核酸链上丢失一个或几个核苷酸而出现的一段缺口。

15、在一些实施方案中，所述ap位点内切酶可以识别ap位点并进行切除磷酸二酯键，形成缺刻或1个碱基的缺口。所述ap位点内切酶是例如ape1(人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，apurinic-apyrimidinic endonuclease 1)，内切酶iii(endonuclease iii)，内切酶iv(endonuclease iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna glycosylase)，内切酶v(endonuclease v)，内切酶viii(endonuclease viii)，ogg1(8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo guanine dna glycosylase 1)，t4 pdg(t4嘧啶二聚体糖基化酶，t4 pyrimidine dna glycosylase)，hneil1(human endonuclease viii-like1)，hnthl1(human nth like dnaglycosylase 1)中的至少一种。

16、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶识别双链dna上的核糖核苷酸位点并切除磷酸二酯键产生缺刻。

17、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是rnase h和rnase hii中的至少一种。

18、在一些实施方案中，所述缺刻位点识别的内切酶，是可以对缺刻位点的dna进行切割形成双链dna断裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位点识别的内切酶是例如t7内切酶i(t7 endonuclease i)和错配内切酶i中的至少一种。

19、在一些实施方案中，所述dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶组成的消化酶组合，或，所述核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶组成的消化酶组合将污染的dna模板切割成双链断裂(附图1)。

20、在一些实施方案中，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是特异性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能选择性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的双链dna；优选地，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda exonuclease)。

21、在一些实施方案中，所述dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶组成的消化酶组合，或，所述核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶组成的消化酶组合将污染的dna模板从缺刻位置的5'磷酸基团开始沿5′→3′方向消化(附图2)。

22、在一些实施方案中，所述方法还包括使消化酶组合失活的步骤，例如高温处理或加入变性剂，例如95℃高温。

23、在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶v和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v和t7内切酶i。

24、在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶。

25、在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和λ核酸外切酶。

26、在一些实施方案中，本公开中的dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶分别指，含有dna糖基化酶活性、ap位点内切酶活性和缺刻位点识别的内切酶活性的消化酶。当某种消化酶含有两种以上前述活性时，所述消化酶组合可以是一种、两种或三种酶，例如内切酶v既含有识别di并将其切割成无嘌呤位点的活性，又能够识别无嘌呤位点并切割形成一个缺刻位点，例如所述消化酶组合可以是内切酶v和t7内切酶i。

27、在一些实施方案中，本公开中的dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶分别指，含有dna糖基化酶活性、ap位点内切酶活性和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶活性的消化酶。当某种消化酶含有两种以上前述活性时，所述消化酶组合可以是一种、两种或三种酶，例如内切酶v既含有识别di并将其切割成无嘌呤位点的活性，又能够识别无嘌呤位点并切割形成一个缺刻位点，例如所述消化酶组合可以是内切酶v和λ核酸外切酶。

28、在一些实施方案中，所述消化酶的组合可以是任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或，任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，或，任意核糖核酸内切酶和和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或核糖核酸内切酶和，5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，包括但不限于前述部分列举的消化酶组合。

29、在一些实施方案中，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，例如30-38℃处理5-20分钟，例如32-37℃处理10-20分钟，例如35-37℃处理10-20分钟，例如37℃处理10-20分钟，例如37℃处理20分钟，例如37℃处理10分钟。

30、在一些实施方案中，当所述消化酶组合是dna糖基化酶，ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合是dna糖基化酶，ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶时，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，例如30-38℃处理5-15分钟，例如32-37℃处理5-15分钟，例如35-37℃处理5-15分钟，例如35-37℃处理5-10分钟，例如37℃处理5-10分钟，例如37℃处理8-10分钟，例如37℃处理10分钟。

31、在一些实施方案中，当所述消化酶组合是核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合是核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶时，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，例如30-38℃处理10-20分钟，例如32-37℃处理10-20分钟，例如35-37℃处理15-20分钟，例如35-37℃处理15-20分钟，例如37℃处理15-20分钟，例如37℃处理18-20分钟，例如37℃处理20分钟。

32、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至少1u的dna糖基化酶，5u的ap位点内切酶和1u的缺刻位点识别的内切酶的组合，或，所述消化酶组合包含至少1u的dna糖基化酶，2.5u的ap位点内切酶和5u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

33、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至少1u的dna糖基化酶，5u的ap位点内切酶和2.5u的缺刻位点识别的内切酶的组合，或，所述消化酶组合包含至少2u的dna糖基化酶，5u的ap位点内切酶和10u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

34、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至多4u的dna糖基化酶，20u的ap位点内切酶和10u的缺刻位点识别的内切酶的组合，或，所述消化酶组合包含至多4u的dna糖基化酶，10u的ap位点内切酶和20u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

35、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至多2u的dna糖基化酶，10u的ap位点内切酶和5u的缺刻位点识别的内切酶的组合，或，所述消化酶组合包含至多2u的dna糖基化酶，5u的ap位点内切酶和20u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

36、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至少2.5u的核糖核酸内切酶和2.5u的nick位点识别的内切酶的排列组合，或，所述消化酶组合包含至少2.5u的核糖核酸内切酶和5u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

37、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至少5u的核糖核酸内切酶和5u的nick位点识别的内切酶的排列组合，或，所述消化酶组合包含至少5u的核糖核酸内切酶和10u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

38、在一些实施方案中，所述消化酶组合包含至多10u的核糖核酸内切酶和10u的nick位点识别的内切酶的排列组合，或，所述消化酶组合包含至多10u的核糖核酸内切酶和20u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，例如对于每ng dna模板。

39、在一些实施方案中，本公开中消化酶组合的使用量相对于非目标核酸模板是过量的。在一些实施方案中，消化酶组合中的每一种酶的过量独立是其上述推荐用量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

40、本公开的第二方面提供一种pcr扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：

41、(1)配制含有目标核酸模板和非目标核酸模板的pcr扩增反应体系，所述反应体系还包括：dna聚合酶，含有修饰位点的引物，缓冲物质、金属盐、dntp和消化酶组合混合，所述dntp包括datp、dgtp、dctp和dttp，所述修饰位点是du或di中的至少一种，所述消化酶组合包括dna糖基化酶和ap位点内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有du或di中的至少一种，所述目标核酸模板中不含有du或di；

42、(2)孵育；

43、(3)在合适的条件下进行扩增反应。

44、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。

45、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中仅含有di时，所述目标模板中不含有di，但可以含有或不含有du；当所述非目标核酸模板中仅含有du时，所述目标模板中不含有du，但可以含有或不含有di；当所述非目标核酸模板中含有du和di时，所述目标模板中不含有du且不含有di。

46、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链dna。在一些实施方案中，所述双链dna至少部分互补。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链含有du或di。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链的引物匹配位置含有du或di。

47、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板来自环境，例如气溶胶。

48、在一些实施方案中，所述引物中修饰的位点在所述引物3'末端的第1-8个核苷酸，例如第1，2，3，5，6，7或8个核苷酸，所述修饰位点有1-8个，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个或8个。

49、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil dnaglycosylase，udg酶)或单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand selective monofunctional uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特异性识别du位点并切除尿嘧啶(uracil，du)从而产生无嘧啶位点。

50、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine dna glycosylase，aag酶)或者内切酶ⅴ(endonuclease v)，所述aag酶或者内切酶ⅴ特异性识别di位点并切除次黄嘌呤(hypoxanthine，di)从而产生无嘌呤位点。

51、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du和di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶可以是分别识别du和di位点的两种酶，包括但不限于前述列举的dna糖基化酶的任意排列组合，例如udg酶和aag酶。

52、在一些实施方案中，所述ap位点内切酶可以识别ap位点并切断磷酸二酯键，形成缺刻或1个碱基的缺口。所述ap位点内切酶是例如ape1(人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，apurinic-apyrimidinic endonuclease 1)，内切酶iii(endonuclease iii)，内切酶iv(endonuclease iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna glycosylase)，内切酶v(endonuclease v)，内切酶viii(endonuclease viii)，ogg1(8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo guanine dna glycosylase 1)，t4 pdg(t4嘧啶二聚体糖基化酶，t4 pyrimidine dna glycosylase)，hneil1(human endonuclease viii-like1)，hnthl1(human nth like dnaglycosylase 1)中的至少一种。

53、在一些实施方案中，所述缺刻位点识别的内切酶，是可以对缺刻位点的dna进行切割形成双链dna断裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位点识别的内切酶是例如t7内切酶i(t7 endonuclease i)和错配内切酶i中的至少一种。

54、在一些实施方案中，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是特异性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能选择性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的双链dna；优选地，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda exonuclease)。

55、在一些实施方案中，所述dna聚合酶是耐热dna聚合酶，优选taq dna聚合酶。

56、在一些实施方案中，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物。

57、在一些实施方案中，所述金属盐包括mg2+盐、k+盐、mn2+盐、na+盐、co2+盐和ca2+盐中的一种或多种。

58、在一些实施方案中，所述缓冲物质包括tris、tris-hcl、tris碱或hepes中的一种或多种。

59、在一些实施方案中，所述步骤(3)的扩增反应包括变性、退火和延伸的步骤；优选包括预变性、变性、退火、延伸、彻底延伸。

60、在一些实施方案中，所述预变性和/或预变性为95℃高温变性，所述消化酶组合在高温下变性失活。

61、在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶v和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v和t7内切酶i。

62、在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶。

63、在一些实施方案中，所述消化酶的组合可以是任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或，任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，包括但不限于前述部分列举的消化酶组合。

64、在一些实施方案中，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，例如30-38℃处理5-15分钟，例如32-37℃处理5-15分钟，例如35-37℃处理5-15分钟，例如35-37℃处理5-10分钟，例如37℃处理5-10分钟，例如37℃处理8-10分钟，例如37℃处理10分钟。

65、在一些实施方案中，所述目标核酸模板是dna模板。

66、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位点内切酶和1u的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位点内切酶和2.5u的缺刻位点识别的内切酶。

67、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、2.5u的ap位点内切酶和5u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、2.5u的ap位点内切酶和10u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。

68、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的smug酶，5u的内切酶iv和1u的错配内切酶i；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的smug酶，5u的内切酶iv和2.5u的错配内切酶i。

69、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的udg酶，5u的ape1酶和1u的t7内切酶i；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的udg酶，5u的ape1酶和2.5u的t7内切酶i。

70、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的udg酶，2.5u的内切酶iii和5u的λ核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少2u的udg酶，5u的内切酶iii和10u的λ核酸外切酶。

71、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少1u的smug酶，2.5u的内切酶viii和5u的λ核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ng dna模板使用至少2u的smug酶，5u的内切酶viii和10u的λ核酸外切酶。

72、在一个实施方案中，dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合以0.5-1.5u:3-7u:0.5-10u，例如0.75-1.25u:4-6u:1-8u，例如0.9-1.1u:4.5-5.5u:1.5-5u，例如1u:5u:2.5u的比例提供。

73、在一个实施方案中，dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合以0.5-1.5u:1.5-3.5u:3-7u，例如0.75-1.25u:2-3u:4-6u，例如1u:2.5u:5u的比例提供。

74、在一些实施方案中，本公开中消化酶组合的使用量相对于非目标核酸模板是过量的。在一些实施方案中，消化酶组合中的每一种酶的过量独立是其上述推荐用量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

75、在一些实施方案中，所述pcr扩增反应体系还包括探针和/或荧光染料，例如taqman荧光探针和/或sybr green荧光染料。

76、本公开的第三方面提供一种pcr扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：

77、(1)配制含有目标核酸模板和非目标核酸模板的pcr扩增反应体系，所述反应体系还包括：dna聚合酶，含有修饰位点的引物，缓冲物质、金属盐、dntp和消化酶组合混合，所述dntp包括datp、dgtp、dctp和dttp，所述修饰位点是ra，ru，rg和rc中的至少一种，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有ra，ru，rg和rc中的至少一种，所述目标核酸模板中不含有ra，ru，rg和rc；

78、(2)孵育；

79、(3)在合适的条件下进行扩增反应。

80、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。

81、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链dna。在一些实施方案中，所述双链dna至少部分互补。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链上含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链的的引物匹配位置含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。

82、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板来自环境，例如气溶胶。

83、在一些实施方案中，所述引物中修饰位点在所述引物3'末端的第1-8个核苷酸，例如第1，2，3，5，6，7或8个核苷酸，所述修饰位点有1-8个，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个或8个。

84、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶识别双链dna上的核糖核苷酸位点并切断磷酸二酯键产生缺刻位点。

85、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是rnase h和rnase hii中的至少一种。

86、在一些实施方案中，所述缺刻位点识别的内切酶可以对缺刻位点的dna进行切割形成双链dna断裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位点识别的内切酶是例如t7内切酶i(t7 endonuclease i)和错配内切酶i中的至少一种。

87、在一些实施方案中，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是特异性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能选择性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的双链dna；优选地，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda exonuclease)。

88、在一些实施方案中，所述dna聚合酶是耐热dna聚合酶，优选taq dna聚合酶。

89、在一些实施方案中，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物。

90、在一些实施方案中，所述金属盐包括mg2+盐、k+盐、mn2+盐、na+盐、co2+盐和ca2+盐中的一种或多种。

91、在一些实施方案中，所述缓冲物质包括tris、tris-hcl、tris碱或hepes中的一种或多种。

92、在一些实施方案中，所述步骤(3)的扩增反应包括变性、退火和延伸的步骤；优选包括预变性、变性、退火、延伸、彻底延伸。

93、在一些实施方案中，所述预变性和/或预变性为95℃高温变性，所述消化酶组合在高温下变性失活。

94、在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和λ核酸外切酶。

95、在一些实施方案中，所述消化酶的组合可以是任意核糖核酸内切酶和和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或核糖核酸内切酶和，5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，包括但不限于前述部分列举的消化酶组合。

96、在一些实施方案中，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，例如30-38℃处理10-20分钟，例如32-37℃处理10-20分钟，例如35-37℃处理15-20分钟，例如35-37℃处理15-20分钟，例如37℃处理15-20分钟，例如37℃处理18-20分钟，例如37℃处理20分钟。

97、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少2.5u的核糖核酸内切酶和2.5u的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少5u的核糖核酸内切酶和5u的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少2.5u的rnase hⅱ和2.5u的t7内切酶ⅰ；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少5u的rnase hⅱ和5u的t7内切酶ⅰ。

98、在一些实施方案中，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少2.5u的核糖核酸内切酶和5u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少5u的核糖核酸内切酶和10u的5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少2.5u的rnase hⅱ和5u的λ核酸外切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少5u的rnase hⅱ和10u的λ核酸外切酶。

99、在一个实施方案中，核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合以0.5-1.5u:0.5-1.5u，例如0.75-1.25u:0.75-1.25u，例如0.9-1.1u:0.9-1.1u，例如1u:1u的比例提供。

100、在一个实施方案中，核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合以0.5-1.5u:1.5-3u，例如0.75-1.25u:1.5-2.5u，例如1u:2u的比例提供。

101、在一些实施方案中，所述pcr扩增反应体系还包括探针和/或荧光染料，例如taqman荧光探针和/或sybr green荧光染料。

102、本公开的第四方面提供一种扩增子文库的构建方法，所述方法包括：

103、(1)获得待测dna样本作为目标核酸模板，获得扩增目标区域的特异性引物对作为引物；

104、(2)使用第二方面或第三方面所述的方法进行pcr扩增；

105、(3)任选地，纯化或不纯化扩增产物；

106、(4)加入带有测序接头序列的引物，通过pcr扩增得到带有接头的核酸片段；

107、(5)任选地，对扩增产物进行纯化。

108、在一些实施方案中，所述扩增目标区域的特异性引物对包含至少一对上游引物和下游引物。

109、在一些实施方案中，所述带有测序接头序列的引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。

110、在一些实施方案中，所述接头序列是当前或将来测序平台(包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台)使用的测序基质相关序列。

111、在一些实施方案中，所述第一接头序列是illumina平台的p5接头序列，所述第二接头序列是illumina平台的p7接头序列，反之亦然。

112、在一些实施方案中，所述第一接头序列是ion torrent平台的p1衔接头序列，所述第二接头序列是ion torrent平台的a衔接头，反之亦然。

113、在一些实施方案中，所述第一接头序列是mgi平台的单端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是mgi平台的单端标签建库下游夹板序列，反之亦然。在一些实施方案中，所述第一接头序列是mgi平台的双端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是mgi平台的双端标签建库下游夹板序列，反之亦然。

114、在一些实施方案中，所述带有测序接头序列的引物还包括索引序列(index)。在一些实施方案中，所述索引序列为例如6-8个碱基，优选8个。

115、在一些实施方案中，所述第一引物是n5引物，所述第二引物是n7引物，反之亦然。

116、在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法，优选磁珠法。

117、本公开的第五方面提供一种病原菌靶向测序文库的构建方法，所述方法包括：

118、(1)获得待测dna样本作为目标核酸模板，所述dna样本来自宿主和病原微生物；获得扩增目标病原微生物目标区域的特异性引物对作为引物；

119、(2)使用第四方面所述的方法进行文库构建。

120、在一些实施方案中，所述宿主是例如人，所述病原微生物是例如真菌、细菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、朊毒体和寄生虫中的一种或多种。

121、本公开的第六方面提供一种基于tngs检测病原微生物的方法，所述方法包括：

122、(1)使用第五方面的方法进行文库构建；

123、(2)上机测序。

124、本公开的第七方面提供第一方面、第二方面和第三方面所述的方法在核酸扩增防污染中的应用。

125、在一些实施方案中，本公开中的rx指组成rna的四种核糖核苷，包括ra(腺嘌呤核糖核苷，腺苷)，ru(尿嘧啶核糖核苷，尿苷)，rg(鸟嘌呤核糖核苷，鸟苷)和rc(胞嘧啶核糖核苷，胞苷)。

126、本公开的第八方面提供一种试剂盒，所述试剂盒用于实施第一方面、第二方面或第三方面所述的方法。

127、在一个实施方案中，本公开的试剂盒包含本公开的消化酶组合试剂，即，dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合，或，dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合，或核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合，或，核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合。

128、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil dnaglycosylase，udg酶)或单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand selective monofunctional uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特异性识别du位点并切除尿嘧啶(uracil，du)从而产生无嘧啶位点。

129、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine dna glycosylase，aag酶)或者内切酶ⅴ(endonucleasev)，所述aag酶或者内切酶ⅴ特异性识别di位点并切除次黄嘌呤(hypoxanthine，di)从而产生无嘌呤位点。

130、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du和di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶可以是分别识别du和di位点的两种酶，包括但不限于前述列举的dna糖基化酶的任意组合，例如udg酶和aag酶。

131、在一些实施方案中，所述ap位点内切酶可以识别ap位点并切断磷酸二酯键，形成缺刻或1个碱基的缺口。所述ap位点内切酶是例如ape1(人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，apurinic-apyrimidinicendonuclease 1)，内切酶iii(endonuclease iii)，内切酶iv(endonuclease iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna glycosylase)，内切酶v(endonuclease v)，内切酶viii(endonuclease viii)，ogg1(8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo guanine dnaglycosylase 1)，t4 pdg(t4嘧啶二聚体糖基化酶，t4 pyrimidine dna glycosylase)，hneil1(human endonuclease viii-like1)，hnthl1(humannthlike dnaglycosylase 1)中的至少一种。

132、在一些实施方案中，所述缺刻位点识别的内切酶可以对缺刻位点的dna进行切割形成双链dna断裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位点识别的内切酶是例如t7内切酶i(t7 endonuclease i)和错配内切酶i(mismatch endonuclease i)中的至少一种。

133、在一些实施方案中，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是特异性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能选择性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的双链dna；优选地，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda exonuclease)。

134、在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iv和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶v和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、ape1酶和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、ape1酶和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v和t7内切酶i。

135、在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶iii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶；在一些实施方案中，所述消化酶组合是内切酶v、内切酶viii和λ核酸外切酶。

136、在一些实施方案中，本公开中的dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶分别指，含有dna糖基化酶活性、ap位点内切酶活性和缺刻位点识别的内切酶活性的消化酶。当某种消化酶含有两种以上前述活性时，所述消化酶组合可以是一种、两种或三种酶，例如内切酶v既含有识别di并将其切割成无嘌呤位点的活性，又能够识别无嘌呤位点并切割形成一个缺刻位点，例如所述消化酶组合可以是内切酶v和t7内切酶i。

137、在一些实施方案中，本公开中的dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶分别指，含有dna糖基化酶活性、ap位点内切酶活性和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶活性的消化酶。当某种消化酶含有两种以上前述活性时，所述消化酶组合可以是一种、两种或三种酶，例如内切酶v既含有识别di并将其切割成无嘌呤位点的活性，又能够识别无嘌呤位点并切割形成一个缺刻位点，例如所述消化酶组合可以是内切酶v和λ核酸外切酶。

138、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶识别双链dna上的核糖核苷酸位点并切除磷酸二酯键产生缺刻位点。

139、在一些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是rnase h和rnase hii中的至少一种。

140、在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和t7内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和错配内切酶i；在一些实施方案中，所述消化酶组合是rnase hii和λ核酸外切酶。

141、在一些实施方案中，所述消化酶的组合可以是任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或，任意dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，或，任意核糖核酸内切酶和和缺刻位点识别的内切酶的排列组合，或核糖核酸内切酶和，5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的排列组合，包括但不限于前述部分列举的消化酶组合。

142、在一个实施方案中，本公开的消化酶组合试剂是单一组合物，即本公开的消化酶组合在单一组合物中提供。在一个实施方案中，本公开的消化酶组合试剂的多个组合物，即本公开的消化酶组合在分开的组合物中提供。

143、在一个实施方案中，dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合以0.5-1.5u:3-7u:0.5-10u，例如0.75-1.25u:4-6u:1-8u，例如0.9-1.1u:4.5-5.5u:1.5-5u，例如1u:5u:2.5u的比例提供。

144、在一个实施方案中，dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合以0.5-1.5u:1.5-3.5u:3-7u，例如0.75-1.25u:2-3u:4-6u，例如1u:2.5u:5u的比例提供。

145、在一个实施方案中，核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶的组合以0.5-1.5u:0.5-1.5u，例如0.75-1.25u:0.75-1.25u，例如0.9-1.1u:0.9-1.1u，例如1u:1u的比例提供。

146、在一个实施方案中，核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶的组合以0.5-1.5u:1.5-3u，例如0.75-1.25u:1.5-2.5u，例如1u:2u的比例提供。

147、在一些实施方案中，本公开的消化酶组合试剂中一种或多种酶的量相对于其余酶是过量的。在一些实施方案中，消化酶组合试剂中的每一种酶的过量独立是其上述推荐量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

148、在一个实施方案中，本公开的试剂盒包含用于实施本公开第一方面、第二方面和第三方面所述方法需要的其它试剂，例如dna聚合酶，引物，缓冲物质、金属盐中的一种或多种。

149、本公开提供上述消化酶组合试剂及其用于实施本公开第一方面、第二方面以及第三方面所述方法和/或制备本公开第八方面所述试剂盒的用途。