用于儿童智力相关基因甲基化的定量检测试剂盒及应用

本发明涉及基因甲基化检测，具体涉及一种用于定量检测人类fam50b基因甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、铅是一种广泛分布的环境重金属污染物，其暴露是人类神经系统疾病的一个重要的独立危险因素。铅对儿童的神经系统和认知功能有负面影响尤其严重。对于正在发育的儿童来说，其中枢神经系统更为敏感，而铅可以穿过血脑屏障，进入大脑，影响神经细胞的正常功能。环境健康风险评估中，血铅、尿铅等生物学指标常用来作为人体铅内暴露水平的生物标志物。血铅是目前最主要的铅的生物标志物，但存在许多局限。全血铅受到个体复杂的毒物动力学所影响，无法区分低水平慢性暴露和高水平短期铅暴露，也难以做到功能性预警。dna甲基化作为被研究最广泛的表观遗产修饰，具有指示疾病的敏感性和可逆性。在越来越多的关联到环境污染物与特定的暴露结局或特定的关键事件等机制中，并作为污染物暴露的指标。

2、dna甲基化(dnam)是一种表观遗传修饰，指的是dna分子中的甲基基团被添加到胞嘧啶碱基c上。这种甲基化通常发生在胞嘧啶的c5位置上，形成5-甲基胞嘧啶(5mc)。dna甲基化在细胞内起着重要作用，可以影响基因表达和细胞功能。例如，dna甲基化与基因沉默之间存在密切的关系。当dna甲基化发生在基因启动子区域时，它通常会导致基因的沉默，阻止rna聚合酶等蛋白质与dna结合，从而抑制基因的转录。在一些疾病的发生和发展如癌症、神经系统疾病和心血管疾病中，dna甲基化对于相应的关键基因的沉默或激活是其中的重要机制。总之，dna甲基化对于细胞分化、基因表达调控和疾病发生具有重要意义，是细胞内重要的表观遗传修饰形式。因此，dnam是监测各种疾病的发生和发展的最有前途的诊断指标。

3、相较于血铅、尿铅等生物标志物，dna甲基化在特定功能的预警上更敏感，其可逆性能够指示用于铅中毒的预防和干预(rachakonda et al.2004)。wan et al.(2018)利用铅污染地区儿童群体血样筛选和验证出与儿童智力相关的基因片段fam50b。细胞实验中发现fam50b基因在血铅与儿童智力的线性关系上表现良好，表明fam50b的dna甲基化可用于血铅对儿童智力影响的定量健康风险评估，具有作为铅暴露下对儿童智力进行预警的潜力(wan et al.2024)。目前仍缺乏儿童智力相关基因dna甲基化水平的实验室定量测定方法。针对特定基因甲基化水平检测的方法只有传统的甲基化检测技术如测序等高成本的方式。

4、目前传统的dna甲基化生物标志物的检测方法包括甲基化特异性pcr(msp)、亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)、基因芯片法等。这些方法较为昂贵，限制了它们在铅诱导的神经发育延迟和环境污染物健康结果的定量风险评估中的应用(hannon et al.2018)。基于实时荧光定量pcr(qpcr)的甲基化分析技术，在结合探针的情况下能够实现甲基化位点的绝对定量，且不需要昂贵的专业设备，在普通的生物学实验室就能完成。目前大多数基于qpcr的甲基化定量检测试剂盒是基于甲基化特异性pcr(msp)，采用甲基化和非甲基化两类探针对目的基因位点的甲基化程度只能做到定性或者半定量检测，无法做到完全定量，因此与测序结果存在一定的差距，而使得其在实际中的应用的可信度受到影响。此外，常见的实时荧光定量pcr方法(qpcr)，大部分是癌症基因早筛试剂盒。已经有许多诊断试剂盒可以用于检测人类样本中的dnam生物标志物，如结肠癌、胃癌、子宫癌和肝癌患者。目前缺少能够对儿童智力相关的生物标志物定量测定而进行损害预警和评估的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于定量检测人类fam50b基因甲基化程度的试剂盒，旨在填补目前关于儿童神智力损害预警方面的基因甲基化定量检测的空白。

2、为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、一种用于定量检测人类fam50b基因甲基化程度的试剂盒，包括fam50b基因检测试剂、内控β-actin基因检测试剂和标准品；所述fam50b基因检测试剂包括fam50b引物对和fam50b探针，fam50b引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示，fam50b探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述内控β-actin基因检测试剂包括β-actin引物对和β-actin探针，β-actin引物对的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，β-actin探针的核苷酸序列如seqid no.6所示。

4、seq id no.1：5’-tggttgtgttggggttataagaaa-3’；

5、seq id no.2：5’-accacccaaaaaaccttacaaca-3’；

6、seq id no.3：5’-tagtggtgcgtaggtaat-3’；

7、seq id no.4：5’-tggtgatggaggaggtttagtaagt-3’；

8、seq id no.5：5’-aaccaataaaacctactcctcccttaa-3’；

9、seq id no.6：5’-accaccacccaacacacaataacaaacaca-3’；

10、其中，所述fam50b探针和β-actin探针的5’端均采用6-fam荧光基团修饰；3’端均采用nfq-mgb荧光淬灭基团修饰。

11、所述标准品是由100％甲基化的fam50b基因和0％甲基化的fam50b基因按不同配比形成的一系列甲基化fam50b基因含量已知的混合核酸样品。

12、采用fam50b基因检测试剂和内控β-actin基因检测试剂，可以对待测核酸样品进行实时荧光定量检测，结合本技术特别研发的质控品，可以实现fam50b基因甲基化位点程度的绝对定量检测。解决了现有的荧光pcr方法不能定量检测fam50b基因甲基化程度的问题；采用本技术的试剂盒进行fam50b基因甲基化程度相对定量检测，只需要采用实验室常规使用的荧光定量pcr检测仪即可，与重亚硫酸盐测序、焦磷酸测序法相比，本技术的试剂盒无需采用特殊的专用设备，成本相对较低。

13、fam50b引物对、fam50b探针、β-actin引物对和β-actin探针，需要配合标准品和标准曲线的使用。因此，本技术的一种实现方式中特别研发了seq id no.1至seq id no.6所示序列两组引物探针组合。本技术试剂盒中引物探针的具体序列，可以在不影响检测特异性、不影响实时荧光定量检测、不影响标准品检测和标准曲线绘制的情况下，在引物探针的5’端或3’端增减若干碱基；特别是，引物的5’端，可以根据需求增加若干碱基的与靶标序列无关的功能核酸片段，例如分子标签等，在此不作具体限定。

14、本技术的试剂盒中还包括dna提取试剂、甲基化转化试剂和实时荧光定量pcr检测试剂中的至少一种。本技术试剂盒中fam50b基因检测试剂和内控β-actin基因检测试剂的使用需要涉及实时荧光定量pcr检测试剂。另外，对核酸甲基化检测还可能涉及dna提取试剂、甲基化转化试剂。dna提取试剂、甲基化转化试剂和实时荧光定量pcr检测试剂都可以自行购买获得，针对不同细胞或组织时可能需要购买其他类型的试剂，如测定人外周血细胞时可以采用外周血dna提取试剂盒，故不在此作具体限定。本技术为了使用方便将其选择性的组合到试剂盒中。另外，本技术试剂盒中的引物探针，具有检测特异性，不排除还可以采用其它方式进行fam50b基因甲基化程度定量检测，例如固相基因芯片、液相基因芯片等；如果采用其它检测技术，也可以在本技术的试剂盒中增加相应的检测试剂，在此不作具体限定。优选的，申请的试剂盒中，fam50b探针的5’端采用6-fam荧光基团修饰，3’端采用nfq-mgb荧光淬灭基团修饰；β-actin探针的5’端采用6-fam荧光基团修饰，3’端采用nfq-mgb荧光淬灭基团修饰。fam50b探针和β-actin探针的荧光淬灭基团可以相同也可以不相同，在此不作具体限定。

15、本技术的试剂盒中，标准品包括甲基化fam50b基因含量依序为0％、25％、50％、75％和100％的混合核酸样品。需要说明的是，本技术的试剂盒中，标准品的作用是用于制备标准曲线；因此，原则上，只要各标准品中甲基化fam50b基因含量能够从0％到100％均匀覆盖即可；0％、25％、50％、75％和100％五个标准品只是本技术的一种实现方式中具体的标准品配制方案。可以理解，标准品的数量越多，在0％到100％分布越均匀，所绘制的标准曲线越准确；但是考虑到标准品的数量越多，相应的试验成本越高；因此，一般采用五个标准品即可准确地绘制出满足使用需求的标准曲线。

16、本发明还提供上述的试剂盒在制备基因fam50b甲基化检测试剂中的应用。

17、本发明还提供上述的试剂盒在制备重金属铅暴露诱导儿童智力损害程度评估和预警产品中的应用。

18、本发明还提供一种用于定量检测人类fam50b基因甲基化程度的方法，包括采用甲基化转化试剂对提取的待测dna样品进行转化，然后采用上述的试剂盒中的fam50b基因检测试剂和内控β-actin基因检测试剂对转化后的待测dna样品进行实时荧光定量pcr检测，根据待测dna样品的ct值计算的甲基化参考百分比值(pmr)判断其基因甲基化程度。

19、优选的，上述的方法还包括采用所述fam50b基因检测试剂和内控β-actin基因检测试剂对上述的试剂盒中的标准品进行实时荧光定量pcr检测，根据标准品的ct值计算得到反映标准品甲基化程度的pmr值，绘制pmr值与fam50b基因已知的甲基化程度的标准曲线；对所述待测dna样品的ct值代入pmr值的计算公式中，即获得待测dna样品的fam50b基因甲基化程度定量结果。

20、本发明还提供上述的方法在血铅对儿童智力影响的定量健康风险评估中的应用，所述的风险评估是以非疾病的诊断或治疗为目的。

21、本发明具有以下有益效果：

22、血铅作为目前最主要的铅的生物标志物，但容易受到个体复杂的毒物动力学所影响，无法区分低水平慢性暴露和高水平短期铅暴露，也难以做到功能性预警。本方法将dna甲基化程度作为儿童智力损害的生物标志物，直接将相关基因位点的甲基化水平与儿童暴露于环境污染物而导致智力受损的风险定量化。

23、目前缺少能够对儿童智力相关的生物标志物定量测定而进行损害预警和评估的方法；本试剂盒的开发填补了目前关于儿童神智力损害预警方面的基因甲基化定量检测的空白。

24、现有方法对fam50b的甲基化检测要么通过测序方法，要么通过甲基化特异性pcr。前者检测需要昂贵的仪器、设备、成本较高；后者需要电泳等步骤、操作繁琐，即使采用染料法，也只能实现对位点甲基化程度的定性而不能定量位点的甲基化程度。本发明建立一种基于qpcr的儿童智力相关基因位点的甲基化检测方法，操作简单，成本较低，精确度和稳定性较高，能做到基因位点甲基化水平的绝对定量，检测结果能够与测序结果相比较，该方法的建立对儿童铅暴露的健康风险评估和智力损害预警有重要意义。

25、本方法采取的试剂盒无需专业的设备、成本节约、门槛低、操作简便、且能够实现甲基化位点的定量测定。