微生物固定化菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及环境修复菌剂，是一种微生物固定化菌剂及其制备方法，以及所述微生物固定化菌剂在修复石油烃污染土壤或石油污染液体培养基中的应用。

背景技术：

1、固定化技术是提高微生物对土壤中石油烃污染降解率的有效途径，固定化菌比游离菌适应环境能力更强，可以抵抗环境毒性，实现多细胞协同作用。多种石油烃高效降解菌，如寡养食单胞菌，芽孢杆菌，假单胞菌属，无色菌属，芽孢杆菌属，小单胞菌属等都可以做成修复土壤石油污染的固定化菌，固定化细胞方式是描述细胞附着方式的术语，包括吸附法，包埋法，共价结合法，细胞交联等方式。固定化方式与载体材料和结构是决定固定化微生物性能的主要因素，现阶段主要的固定化方式主要有吸附法，包埋法，交联法。吸附法和包埋法是目前最常用的两种方法，吸附法包括物理吸附和离子吸附，物理吸附使用的是如硅藻土，活性炭等具有高吸附能力的物质，离子吸附是利用微生物带电的表面特性，利用离子键将微生物固定于带有相反电荷的固定材料上。包埋法是将细胞分散到多孔性载体内部，或利用高聚物形成凝胶时将细胞包埋在内部，从而达到固定细胞的目的。

2、固定化载体材料的主要作用是为微生物提供适宜生存的微环境，不同的制备方法与工艺生成的材料性能各不相同。载体的比表面积、孔隙大小、结构是选择固定化材料的主要依据，这些因素显著影响微生物负载量。常用的固定化载体材料包括:海藻酸盐、琼脂、卡拉胶、明胶、硅藻土、高岭土、活性炭、秸秆、椰子壳等。现在应用比较多的是各种天然材料或改性天然材料，这些材料可以用于土壤环境的原位修复而不用考虑回收问题。生物炭作为天然有机质载体材料，可以发挥其降低土壤的密度，提高土壤的持水力，改良土壤性质，增强土壤肥力等优势。高分子材料海藻酸钠和聚乙烯醇等载体具有较好的机械强度和硬度，可以保护吸附在麸皮生物炭上的细菌，所制备的固定化菌剂不易变形和遭到破坏。因此将高分子材料和天然有机质材料结合成一种复合材料，可以充分发挥各个材料的优势。此外，载体材料的改性可以通过改变载体表面的官能团等，提高污染物的去除效率。因此本发明以改性载体材料为载体，通过吸附-包埋法制备一种改性生物炭基复合固定化菌剂。

技术实现思路

1、本发明提供了一种微生物固定化菌剂及其制备方法和应用，所述微生物固定化菌剂能有效降解石油烃，修复被油烃污染的土壤。

2、第一方面，本发明提供一种微生物固定化菌剂的制备方法，包括：

3、将香茅醇假单胞菌、巴基斯坦鞘氨醇杆菌、嗜麦寡养食单胞菌三种菌种混合培养得到菌悬液；将三种菌种通过吸附-包埋固定化方式固定后得到微生物固定化菌剂；吸附-包埋固定化方式如下：

4、向菌悬液中加入腐殖酸改性生物炭和无机盐营养基，使所述菌种充分吸附在改性生物炭上，然后向菌悬液中加入海藻酸钠与聚乙烯醇的混合液，培养后，得到改性生物炭复合菌种混合液，将改性生物炭复合菌种混合液加入氯化钙溶液中，然后清洗、干燥得到微生物固定化菌剂。

5、进一步地，改性生物炭按下述方法得到：将生物炭与腐殖酸、柠檬酸的混合溶液混合震荡后，并经自然干燥后得到改性生物炭。

6、生物炭在与腐殖酸、柠檬酸的混合溶液混合之前，先洗净。洗净后的生物炭的目数为80目至40目；腐殖酸、柠檬酸的混合溶液中，所述腐殖酸和柠檬酸的质量比为5至10:1（例如：5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1），洗净后的生物炭的质量与腐殖酸、柠檬酸的混合溶液的体积比为1:2至4:5（例如：1:2，2:3，4:5），单位分别为g和ml；震荡时间为2h至4h（例如：2h，3h，4h）；自然干燥的温度为25℃至30℃（例如：25℃，26℃，27℃等）。

7、腐殖酸改性生物炭（即改性生物炭）可以在一定程度上可以促进土壤中多酚氧化酶、过氧化氢酶的活性。

8、进一步地，石油类有机污染物修复的复合菌的培养：

9、（1）用于石油类有机污染物修复的复合菌包括： pseudomonas citronellolis（香茅醇假单胞菌）、 sphingobacterium pakistanensis（巴基斯坦鞘氨醇杆菌）、 stenotrophomonas maltophilia （嗜麦寡养食单胞菌），分别标记为b1、b2、b3，三株混合菌标记为3b。

10、（2）复合菌培养基配方：lb培养基的组成及配方如下：称取nacl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，加入1 l蒸馏水溶解，ph值调至7.0至7.5，121 ℃灭菌20分钟。

11、复合菌的培养方法：将筛选得到的香茅醇假单胞菌、巴基斯坦鞘氨醇杆菌、嗜麦寡养食单胞菌三株菌等量以lb液体培养基体积的10%至20%接种量接种于100 ml lb液体培养基中，培养18h至菌种对数生长期后，用无菌的0.9% nacl溶液洗涤三次，再加入的0.9%nacl溶液即可得到菌悬液，菌悬液为100 ml。

12、进一步地，复合菌的吸附-包埋固定化方法：

13、（1）海藻酸钠-聚乙烯醇混合液的制备：海藻酸钠-聚乙烯醇的质量比为2:1。

14、具体为：于锥形瓶中加入2 g海藻酸钠，1 g聚乙烯醇，加入25 ml 0.9% nacl溶液，121 ℃灭菌20分钟后，摇匀备用。

15、4% cacl2溶液的配置：100 ml蒸馏水中加入4 g cacl2，再加入一定量的硼酸调节ph为6.8。

16、（2）复合菌的吸附-包埋固定化：在菌悬液中加入改性生物炭，以及灭菌后的无机盐营养基（5%至10%nacl、0.3%至0.5% kh2po4、0.1%至0.2%尿素、1%至2%na2hpo4·2h2o），混匀2 h。让混菌充分吸附到改性生物炭上。然后将海藻酸钠-聚乙烯醇的混合液与生物炭-菌液混合，置于摇床中，混匀（培养）15 min后，用胶头滴管逐滴滴加到4% cacl2溶液中。再用0.9% nacl洗三次后置于一次性培养基上，自然晾干。即可得到微生物固定化菌剂。

17、改性生物炭的加入量为每100ml菌悬液加入3g至5g改性生物炭。

18、第二方面，本发明提供一种微生物固定化菌剂，其采用所述微生物固定化菌剂的制备方法制备得到。

19、第三方面，本发明还提供一种微生物固定化菌剂在修复石油烃污染土壤或石油污染液体培养基中的应用。

20、（1）所制备的微生物固定化菌剂在石油污染液体培养基中的应用，在液体培养基中加入浓度为1%至5%的原油，按照质量比2%至5%添加微生物固定化菌剂，在30℃至35℃摇床培养，7d后测定降解率。

21、（2）所制备的微生物固定化菌剂在石油污染土壤中的应用：向含原油2%至5%（质量比）的石油污染土壤中调整含水率至20%至30%，按质量比1%至5%加入微生物固定化菌剂，混合均匀。在人工气候箱中，25℃至30℃条件下修复30d至60d，土壤含水率维持在20%至30%。

22、本发明所述微生物固定化菌剂适用于处理饱和烃含量在50%至70%的原油污染土壤。

23、本发明采用改性生物炭结合吸附-包埋固定化方式对三种菌种处理，可以帮助微生物抵制外界环境的毒性干扰，增强微生物活性，提高氧气和水分子的传递速率，增强微生物的生物活性及降解相关酶活性，提升微生物固定化菌剂在新环境中的竞争力，增强菌剂的吸附降解性能。