一种光甘草定前体4′-O-Methylpreglabridin的生物合成方法

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明是有关于生物合成光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin的一种方法。

背景技术：

1、4′-o-methylpreglabridin目前仅从热带树(diphysa robinioides benth.)和类芒齿黄芪(astragalus camptodontoides)分离得到，是存在于豆科植物中的一种稀有异黄烷类化合物，研究表明4′-o-methylpreglabridin在抗菌方面具有较好的活性(isoflavansand a stilbene from wood of the decay-resistant tropical tree diphysarobinioides.doi:10.1021/np50046a022)。目前获取4′-o-methylpreglabridin的方法是从植物中直接提取分离，如韩冰洋、张宇、田新雁、肖朝江等发表的chemical constituentsfrom underground part of astragalus camptodontoides(类芒齿黄芪地下部分化学成分研究),《广西植物》，2016年第11期,而化学合成的方法尚未见报道。从植物中获取4′-o-methylpreglabridin需要消耗大量的基原植物，过量采挖破坏生态环境，造成植物资源严重匮乏。目前4′-o-methylpreglabridin的市场价格昂贵。因此，为满足市场需求，迫切需要发展绿色高效的4′-o-methylpreglabridin获取方法。

2、近年来，随着基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程等现代生物技术迅速发展，通过大肠杆菌、酵母等生物合成中药药效成分以代替传统方法已成为可能。利用合成生物学技术实现中药活性成分的绿色生物制造，可有效缓解药用植物资源短缺、珍稀濒危资源被破坏的问题，为中药质量提升和产业高质量发展提供新的机遇。因此，利用合成生物学方法合成4′-o-methylpreglabridin是一种经济高效的方式，能够有效解决4′-o-methylpreglabridin的资源可持续利用问题，也可为进一步生物合成“美白黄金”光甘草定提供充足的前体物质。

3、本发明利用生物信息学分析、挖掘，生化实验鉴定了美迪紫檀素到光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin生物合成相关的2个关键酶基因——二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)和紫檀碱还原酶(ptr)，通过同源重组或双酶切方法构建相应质粒并转化至大肠杆菌或酿酒酵母感受态细胞中，通过蛋白表达、纯化以及酶活性测定来获取高价值活性化合物光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin。

技术实现思路

1、本发明的目的是，在现有技术的基础上，筛选出一种经济高效、绿色环保的方法，即生物合成具有抗菌活性的化合物——光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin。

2、本发明利用合成补骨脂来源的二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)质粒，将pcm4dt基因片段和载体pesc-ura进行同源重组，获得正确重组质粒后电转至酿酒酵母菌株imx581中，涂布于尿嘧啶缺陷型固体培养基(sc-ura)中，30℃培养三天；待长出菌落后，挑选阳性克隆于尿嘧啶缺陷型液体培养基(sc-ura)中培养(30℃，210rpm)，当od值达到0.8后换至诱导培养基(2％半乳糖)中继续培养，三天后收菌；菌体经高压破碎仪破碎，上清液经超速离心机离心以获得pcm4dt微粒体。以美迪紫檀素和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)作为底物，加入pcm4dt微粒体于30℃水浴锅中反应，uplc检测其基因表达产物，生成licoagrocarpin。

3、本发明从光果甘草cdna中克隆紫檀碱还原酶(ptr)基因，将ptr基因片段和载体pet-28a进行酶连，获得正确重组质粒后转化至大肠杆菌bl21感受态中，涂布于固体培养基中，37℃过夜培养；待长出菌落后，挑选阳性克隆于液体培养基中培养(37℃，165rpm)，当od值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mm/l的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)于18℃摇床中继续培养12小时；将菌液利用落地式高速冷冻离心机离心15min(5000rpm，4℃)，获得的菌体经高压破碎仪破碎，裂解物离心以除去细胞碎片；上清液和ni2+-nta树脂于4℃旋转结合40min后利用ni2+-nta亲和层析柱的柱料过柱，再利用不同浓度的咪唑进行洗脱以获得紫檀碱还原酶(ptr)目标蛋白。以licoagrocarpin作为底物，加入ptr蛋白于30℃水浴锅中反应，uplc检测其基因表达产物，生成4′-o-methylpreglabridin。

4、一种4′-o-methylpreglabridin的生物合成方法，包括以下步骤：

5、(1)合成含二甲基烯丙基转移酶基因(pcm4dt)的质粒，转入酿酒酵母菌株imx581后培养酵母菌以表达蛋白，纯化并经超速离心获得微粒体后经酶活测定；将美迪紫檀素和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)在二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)的作用下可获得化合物1—licoagrocarpin，分子式c21h22o4，结构式如下：

6、

7、(2)构建含紫檀碱还原酶基因(ptr)的质粒，转入大肠杆菌感受态bl21后培养大肠杆菌以表达蛋白，纯化获得蛋白后经酶活测定；将licoagrocarpin在紫檀碱还原酶(ptr)作用下可获得化合物2—光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin，分子式c21h24o4，结构式如下：

8、

9、作为优选方案，以上所述的一种4′-o-methylpreglabridin的生物合成方法，包括以下步骤：

10、(1)美迪紫檀素和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)在二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)的催化下生成licoagrocarpin

11、

12、300μl酶反应体系为：缓冲液tris-hcl ph8.8(1m/l)60μl，mgcl2(1m/l)9μl，还原型辅酶ⅱ(nadph)(10mm/l)60μl，底物美迪紫檀素(10mg/ml)1.7μl，底物二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)(20mm/l)9μl，二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)液体补至300μl，混匀。于水浴锅中30℃反应过夜后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液后离心浓缩至干，后加甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，得licoagrocarpin；

13、(2)licoagrocarpin在紫檀碱还原酶(ptr)的催化下生成光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin

14、

15、300μl酶反应体系为：缓冲液kh2po4 ph7.5(1m/l)30μl，mgcl2(1m/l)1.5μl，蔗糖(2m/l)44μl，还原型辅酶ⅱ(nadph)(10mm/l)30μl，底物licoagrocarpin(10mg/ml)1.3μl，紫檀碱还原酶(ptr)500μg，超纯水补至300μl，混匀，于水浴锅中30℃反应过夜后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液后离心浓缩至干，后加甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，得光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin。

16、有益效果：本发明通过实验筛选出美迪紫檀素到光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin生物合成中的2个关键酶：二甲基烯丙基转移酶(pcm4dt)和紫檀碱还原酶(ptr)，经同源重组或双酶切方法构建相应质粒并转化至大肠杆菌或酿酒酵母感受态细胞中，通过蛋白表达、纯化以及酶活测定来获取高价值活性化合物光甘草定前体4′-o-methylpreglabridin。本发明合成方法经济高效、绿色环保，合成得到的4′-o-methylpreglabridin纯度高。