区分蓟马科微小昆虫的简并引物、试剂盒及其应用

本发明属于生物，尤其涉及一种区分蓟马科微小昆虫的简并引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、缨翅目thysanoptera昆虫统称蓟马thrips，属于小型昆虫，细长而略扁，体长多为0.5～2mm左右，最大者只有15mm，下分为锯尾亚目terebrantia和管尾亚目tubulifera，包括管蓟马科、蓟马科、纹蓟马科和异蓟马科等，其中，蓟马科为锯尾亚目中最大的科，全世界已知280余属2100余种。蓟马科昆虫通过锉吸式口器锉破植物表皮组织而吮吸汁液，使嫩梢干缩，籽粒干瘪，除此之外，有一些蓟马还可传播植物病毒，对植物造成危害。

2、蓟马科中有一些种类为众所周知的农林经济害虫，直接或间接的破坏经济作物，使其经济价值降低，比如：西花蓟马frankliniella occidentalis(pergande)寄主范围广泛，包括禾本科、豆科、菊科及十字花科等在内的66个科500多种寄主植物，该虫以锉吸式口器取食植物的叶、茎、花、果实，除了直接为害作物之外，还是众多植物病毒病的传播载体，这种间接通过携带传播病毒为害作物，从而造成的经济损失远比西花蓟马本身直接为害造成的更加严重；烟蓟马thrips tabaci lindeman传播的番茄斑萎病毒遍及整个世界，严重危害番茄、烟草、莴苣、菠萝、马铃薯和一些观赏性植物。据统计，番茄斑萎病对全球经济造成的损失高达数十亿美元。目前已知的能够传播植物病毒的种类主要集中在蓟马科的花蓟马属frankliniella和蓟马属thrips，也包括了少数其它属的种类。

3、在更新的一类农作物病虫害名录中包括了蓟马科的西花蓟马、瓜蓟马、西花蓟马和花蓟马，间接说明了蓟马科对农业造成的损失较大，然而在蓟马科微小昆虫鉴定方面，对于普通人来说较为困难，可能造成无法对症下药的情况出现，因此如何快速准确有效的鉴定蓟马科微小昆虫是一个值得研究的问题。

4、蓟马科微小昆虫鉴定困难主要包括以下方面：首先，蓟马科微小昆虫的生物学鉴定需通过其鬃毛、单眼、触角等部位进行区分鉴定，但是蓟马科微小昆虫的成、若虫等体型微小，其形态鉴定需在高倍清晰的显微镜下拍摄进行，对鉴定的设备要求较高，成本较高；其次，对于非蓟马研究者，需要耗费较多的时间和精力去学习和鉴定，因此蓟马科微小昆虫的生物学鉴定难度较大；最后，国内的蓟马形态学分类鉴定的研究日益加强，但是分子鉴定方面的研究较少。

技术实现思路

1、发明目的：为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种区分蓟马科微小昆虫的简并引物，能够更准确有效便捷的鉴定蓟马科微小昆虫的种类。

2、本发明还提供了用于区分蓟马科微小昆虫的试剂盒及其应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述区分蓟马科微小昆虫的简并引物对为lm-f/lm-r，所述lm-f为序列如seq id no.1所示，所述lm-r为序列如seq id no.2所示。

4、进一步地，所述lm-f包括seq id no.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.1具有相同功能的单链dna分子；所述lm-r包括seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.1具有相同功能的单链dna分子。

5、其中，本发明鉴定蓟马科微小昆虫的试剂盒，包含简并引物对lm-f/lm-r。

6、本发明所述简并引物对或所述试剂盒的应用，包括如下应用任意一种：

7、(1)制备鉴定蓟马科微小昆虫的产品；

8、(2)鉴定蓟马科微小昆虫；

9、(3)制备鉴定待测微小昆虫是否为蓟马科微小昆虫的产品；

10、(4)鉴定待测微小昆虫是否为蓟马科微小昆虫；

11、(5)制备西花蓟马的疫情监测的产品；

12、(6)西花蓟马的疫情监测；

13、(7)制备预防西花蓟马的入侵和/或扩散的产品；

14、(8)预防西花蓟马的入侵和/或扩散。

15、本发明所述简并引物对或所述试剂盒的应用，还包括如下应用任意一种：

16、(1)鉴定西花蓟马、棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马微小昆虫；

17、(2)制备鉴定西花蓟马、棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马微小昆虫的产品；

18、(3)制备西花蓟马、棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马微小昆虫的监测的产品；

19、(4)制备预防西花蓟马、棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马微小昆虫的扩散的产品；

20、(5)预防西花蓟马、棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马微小昆虫的扩散。

21、本发明所述简并引物对或所述试剂盒的在筛选或区分蓟马科微小昆虫中的应用。

22、其中，利用所述简并引物对或所述试剂盒在筛选或区分蓟马科微小昆虫的方法，包括如下步骤：

23、(1)提取待测样本dna；

24、(2)以步骤(1)待测样本dna为模板，利用所述简并引物对进行pcr扩增；

25、(3)根据pcr扩增产物的大小区分或筛选蓟马科微小昆虫。

26、进一步地，所述pcr反应体系为：dna模板2μl、正向引物(10μm)1μl、反向引物(10μm)1μl、2×taq pcr mastermix 12.5μl和ddh2o 8.5μl组成。

27、进一步地，所述pcr反应条件为：95℃预变性5min，进行35个循环包括95℃变性75s，55℃退火30s，72℃延伸60s，继续72℃延伸10min。

28、进一步地，以待测蓟马科微小昆虫的基因组dna为模板，采用所述的引物对进行pcr扩增，若pcr扩增得到大小为700bp左右的目的片段，则待测微小昆虫为蓟马科微小昆虫，将待测蓟马科微小昆虫的pcr产物进行测序，得到的序列进行比对，得到具体种类，若简并引物对pcr扩增未得到目的片段，则为非蓟马科微小昆虫。

29、作为优选，本发明提供的简并引物对由lm-f和lm-r组成；

30、所述lm-f为如下a1)或a2)或a3)：

31、a1)序列表中序列seq id no.1所示的单链dna分子；

32、a2)将序列seq id no.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；

33、a3)将序列seq id no.1经过一个或几个碱基的增加和/或减少且与序列seq idno.1具有相同功能的单链dna分子。

34、所述lm-r为如下a4)或a5)或a6)：

35、a4)序列表中序列seq id no.2所示的单链dna分子；

36、a5)将序列seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列seq id no.2具有相同功能的单链dna分子。

37、a6)将序列seq id no.2经过一个或几个碱基的增加和/或减少且与序列seq idno.2具有相同功能的单链dna分子。

38、进一步的，所述引物对中的两条单链dna分子的摩尔比均为1:1。

39、所述引物对中的两条单链dna分子均独立包装。

40、本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定蓟马科微小昆虫的试剂盒。

41、本发明提供的试剂盒包括上述成套引物对。

42、进一步的，所述试剂盒还可包括用于进行常规pcr扩增的试剂，如2×taq pcrmastermix和ddh2o等。

43、本发明的第三个目的是提供上述引物对或上述试剂盒的新用途。

44、本发明还提供了所述简并引物对或上述试剂盒在如下c1)-c11)中任一种中的应用：

45、c1)制备鉴定蓟马科微小昆虫的产品；

46、c2)鉴定蓟马科微小昆虫；

47、c3)制备鉴定待测昆虫是否为蓟马科微小昆虫的产品；

48、c4)鉴定待测昆虫是否为蓟马科微小昆虫；

49、c5)制备西花蓟马的疫情监测的产品；

50、c6)西花蓟马的疫情监测；

51、c7)制备预防西花蓟马的入侵和/或扩散的产品；

52、c8)预防西花蓟马的入侵和/或扩散；

53、c9)制备棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马等蓟马科微小昆虫的监测的产品；

54、c10)制备预防棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马等蓟马科微小昆虫的扩散的产品；

55、c11)制备预防棕榈蓟马、花蓟马、烟蓟马、黄胸蓟马、豆喙蓟马和普通大蓟马等蓟马科微小昆虫的扩散。

56、本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测微小昆虫是否为蓟马科微小昆虫的方法。

57、本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测待测微小昆虫是否为蓟马科为小昆虫的方法包括如下步骤：以待测微小昆虫的基因组dna为模板，采用上述引物对甲进行pcr扩增；若引物对甲pcr扩增得到大小为700bp左右的目的片段，则待测微小昆虫为蓟马科微小昆虫；若引物对甲pcr扩增未得到目的片段，则为非蓟马科微小昆虫。

58、所述lm-f和所述lm-r在所述pcr反应体系中的终浓度均为0.4μm。

59、本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定蓟马科微小昆虫的具体种类的方法。

60、本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测鉴定蓟马科微小昆虫的具体种类的方法包括如下步骤：将跑出条带的pcr产物送至生物公司进行测序，得到的序列放至ncbi网站进行blast比对。

61、上述任一所述方法中，所述微小昆虫可为蓟马科微小昆虫。

62、所述蓟马科为小昆虫具体可为所述蓟马科微小昆虫的卵、若虫、伪蛹和/或成虫。

63、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

64、1、本发明设计的特定简并引物为具有筛选功能的通用引物，无须针对特定的蓟马科微小昆虫设计特定的引物，方便快捷，通用性好，工作效率高，能够更准确有效便捷的鉴定蓟马科微小昆虫的种类。

65、2、本发明的基于常规pcr的分子鉴定技术可以实现对微小昆虫和蓟马科微小昆虫的区分以及蓟马科微小昆虫具体种类的鉴定，具有特异性强、准确性高、成本低、操作简单、耗时短的优点，不仅解决了不同虫态蓟马科微小昆虫及蓟马科微小昆虫残体的种类鉴定问题，也为重要蓟马害虫的疫情监测提高准确的技术手段。

66、3、本发明设计的简并引物以及检测方法为蓟马科微小昆虫的分布及入侵现状、以及其后续的植物检疫及田间治理提供了实用技术和理论依据，对有效预防其进一步的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展具有重要意义。