嗜盐菌菌种保护剂及其应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种保藏，尤其涉及一种嗜盐菌菌种保护剂及其应用。

背景技术：

1、菌种保藏主要是指通过降低细胞新陈代谢速度，使细胞生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的。菌种保藏有助于减少菌种更新需求，降低实验生产成本。普通微生物的菌种保藏方法有斜面保藏法、液体石蜡油保藏法、沙土保藏法(适合产孢菌种)、-80℃低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。其中，在低温条件下保藏菌种一般需要加入相应的保护剂，以减少极端环境对菌体的伤害。

2、目前市面上的保护剂种类较多，常见的有脱脂乳类保护剂和复合保护剂。其中，脱脂乳类保护剂是利用蛋白质和糖等成分在水体系中形成稳定胶体结构，进而在菌体周围形成蛋白质分子保护层，发挥阻止菌体聚合及保护菌体的作用。脱脂乳类保护剂通常能满足大部分菌种的保藏需求。复合保护剂通常会结合待保藏菌种自身特点，将多种原料成分如交联剂、增稠剂、抑菌剂、甘油、酪蛋白、小分子多糖等复配得到。在特定菌种的保藏中，复合保护剂通常能发挥相较更好的保护效果。

3、嗜盐细菌是指只有在含盐的环境才能生长的微生物，按最适宜生长所需的盐量，分为中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。中度嗜盐菌指在含盐浓度为3％～15％的环境中能良好生长的微生物，极端嗜盐菌是指在含盐浓度为15％～30％的介质中也能良好生长的微生物，最适宜生长浓度为20％～25％，甚至在饱和浓度中也能生长。有研究表明，真空冷冻干燥法搭配传统脱脂乳类保护剂用于保藏部分嗜盐菌，保藏一年后的存活率不足25％。因此，真空冷冻干燥法搭配传统脱脂乳类保护剂无法满足嗜盐菌的保藏需求。目前有关嗜盐菌菌种保护剂的研究较少，亟需开发适合嗜盐菌菌种(尤其是基于合成生物学的一种敲除部分外膜的基因改造的嗜盐菌)保藏需求的新的保护剂产品。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种适合嗜盐菌菌种保藏的保护剂及其应用。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种嗜盐菌菌种保护剂，所述嗜盐菌菌种保护剂包含海藻糖脂、渗透压调节剂、增稠剂和水；海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5-5％。

4、本发明尝试寻找新的适合嗜盐菌菌种保藏的保护剂，尤其是一种基于敲除部分外膜的嗜盐菌的菌种保藏用保护剂。用以降低低温保存过程中菌种的死亡率，结果意外地发现海藻糖脂对嗜盐菌的低温保存具有良好保护效果：当海藻糖脂浓度为0.5-5wt％时，其对嗜盐菌进行低温冻存一年后的菌种存活率可提高20％左右，对敲除部分外膜的嗜盐菌进行低温冻存一年后的菌种存活率可提高30％以上。

5、在本发明中，海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5％，1.0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％，4.0％，4.5％，5.0％，或者以上任意两个数值组成的数值区间内的值。优选地，海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为2.5-3％。该区间范围得到的嗜盐菌菌种保护剂对菌种的保存效果相较更好。

6、在本发明中，所述嗜盐菌菌种保护剂包含渗透压调节剂。

7、优选地，所述渗透压调节剂选自无机盐。其中，所述无机盐可选自无机钠盐和/或无机钾盐。例如，本发明所述的无机盐可以包括但不限于氯化钠和/或柠檬酸钠；也可以用钾盐替代，如氯化钾和/或柠檬酸钾等；或者是其中钠盐与钾盐的任意组合。本发明通过添加渗透压调节剂，调节保护剂中的离子浓度，有助于保证嗜盐菌菌体细胞内外渗透压平衡，并能维持ph的相对稳定，更适于嗜盐菌生存。

8、优选地，所述渗透压调节剂和所述海藻糖脂的质量比为0.5-10:0.5-5。

9、进一步优选地，所述渗透压调节剂选自氯盐和/或柠檬酸盐；当所述渗透压调节剂中含有氯盐时，所述氯盐和所述海藻糖脂的质量比为2-10:0.5-5；当所述渗透压调节剂中含有柠檬酸盐时，所述柠檬酸盐和所述海藻糖脂的质量比为0.5-2.5:0.5-5。

10、在本发明中，所述嗜盐菌菌种保护剂包含增稠剂。

11、添加增稠剂有助于更好地分散菌株细胞，提高海藻糖脂的保护效果。

12、在本发明中，所述增稠剂和所述海藻糖脂的质量比优选为5-30:0.5-5。

13、进一步优选地，所述增稠剂选自甘油和/或脱脂乳粉；当所述增稠剂中含有甘油时，所述甘油和所述海藻糖脂的质量比为10-30:0.5-5；当所述增稠剂中含有脱脂乳粉时，所述脱脂乳粉和所述海藻糖脂的质量比为5-15:0.5-5。

14、在本发明提供的其中一种较为具体的实施方式中，所述嗜盐菌菌种保护剂为冻存保护剂(由液体直接在低温环境下冻存，不同于真空冷冻干燥保藏)。

15、所述冻存保护剂优选包含10-30％的甘油，2-10％的氯化钠和/或氯化钾，0.5-2.5％的柠檬酸钠和/或柠檬酸钾，0.5-5％的海藻糖脂。

16、更优选地，所述冻存保护剂包含15±1％的甘油，3±0.5％的氯化钠，1.0±0.5％的柠檬酸钠和0.5-5％的海藻糖脂。

17、经验证，本发明提供的冻存保护剂对嗜盐菌进行-80℃低温冻存一年后的菌种存活率在88％以上，存活率可提高20％左右；对敲除部分外膜的嗜盐菌进行-80℃低温保存一年后的菌种存活率达80％，存活率可提高30％以上。

18、在本发明提供的另一种较为具体的实施方式中，所述嗜盐菌菌种保护剂为冻干保护剂。

19、所述冻干保护剂优选包含5-15％的脱脂乳粉，2-10％的氯化钠和/或氯化钾，0.5-2.5％的柠檬酸钠和/或柠檬酸钾，0.5-5％的海藻糖脂。

20、更优选地，所述冻干保护剂包含10±1％的脱脂乳粉，3.0±1％的氯化钠，1.0±0.5％的柠檬酸钠和0.5-5％的海藻糖脂。

21、经验证，本发明提供的冻干保护剂对嗜盐菌进行冻干-20℃保存一年后的菌种存活率在70％以上，存活率可提高25％；对敲除部分外膜的嗜盐菌进行冻干-20℃保存一年后的菌种存活率在60％左右，存活率可提高50％以上。

22、本发明提供的嗜盐菌菌种保护剂适于嗜盐菌的菌种保存，尤其适于敲除部分外膜的嗜盐菌。

23、本发明对敲除外膜的具体手段不作特别限定，本领域常规方法(例如公开文献“ziyu wang et al.,2021.engineering the permeability of halomonasbluephagenesis enhanced its chassis properties”记载的敲除外膜方法)均可。

24、在本发明中，所述敲除部分外膜的嗜盐菌是指敲除嗜盐菌基因组中与外膜脂多糖合成和修饰相关的基因，获得的外膜缺陷型菌株。故其自身抗逆性较差，对抗生素、温度、ph更加敏感，外膜通透性更强，细胞壁更容易破碎，故在极端环境中更难维持细胞的完整性，较常规嗜盐菌的保藏难度更高。本发明提供的嗜盐菌菌种保护剂中的海藻糖酯或可能与嗜盐菌外膜部分结合，形成屏障相对‘修复’其外膜的完整性，从而保护菌体抵抗外界的恶劣环境。

25、在本发明提供的具体实施方式中，敲除部分外膜的嗜盐菌2选自清华大学陈国强团队构建的halomonas bluephagenesis wzy254菌株，公开于“ziyu wang et al.,2022.hyperproduction of pha copolymers containing high fractions of 4-hydroxybutyrate(4hb)by outer membrane-defected halomonas bluephagenesis grownin bioreactors[j].microbial biotechnology”。敲除部分外膜的嗜盐菌3选自wzy09菌株，公开于“ziyu wang et al.,2021.engineering the permeability of halomonasbluephagenesis enhanced its chassis properties”。嗜盐菌1为敲除部分外膜的嗜盐菌2的前身(即halomonas bluephagenesis td01菌种，保藏登记号为cgmccno.4353，从清华大学获得)。

26、第二方面，本发明提供了所述嗜盐菌菌种保护剂在嗜盐菌保存中的应用，所述应用包括如下方式(1)或(2)：

27、(1)使用所述嗜盐菌菌种保护剂，将嗜盐菌配制成1×108～1×1010cfu/ml的菌悬液，-80℃～-60℃保存；

28、(2)使用所述嗜盐菌菌种保护剂，将嗜盐菌配制成1×108～1×1010cfu/ml的菌悬液，然后经真空冷冻干燥，真空封熔后于-25℃～-15℃保存。

29、优选地，所述嗜盐菌菌种保护剂在使用前进行高温灭菌：119-121℃灭菌10-20分钟即可。

30、本发明对所述嗜盐菌菌种保护剂的各项指标进行了检查，主要包括生长培养、菌落形态、存活率、生产能力、传代稳定性等。检查结果表明：本发明所述嗜盐菌菌种保护剂对嗜盐菌的保护效果显著，菌落形态、生长培养、及生产能力等方面在保存一年后未发现变化，说明保护剂对菌种保藏质量有效；在菌种数量上与原脱脂乳粉或甘油做单一保护剂相比有一定提高，但对于敲除部分外膜的基于合成生物学改造的嗜盐菌种，在菌体数量上有明显的提高，甚至存活率可提高50％以上。菌种连续传至7代，生产稳定性良好。可见本发明提供的嗜盐菌菌种保护剂对于敲除部分外膜的嗜盐菌保存方面有明显优势。

31、第三方面，本发明提供了一种嗜盐菌菌剂，其包含嗜盐菌，还包含所述嗜盐菌菌种保护剂。其中，所述嗜盐菌可以是敲除部分外膜的嗜盐菌，其在所述嗜盐菌菌种保护剂的作用下，存活情况有显著改善。

32、有益效果：

33、本发明提供了一种适合嗜盐菌菌种保藏的保护剂，其以海藻糖脂作为主要成分，在高盐、低温等极端保存条件下能更好地维持细胞物质稳定，从而保护嗜盐菌的菌体细胞完整，尤其是对于敲除部分外膜的嗜盐菌，具有更好的保护菌体完整效果。将本发明提供的嗜盐菌菌种保护剂应用于敲除部分外膜的嗜盐菌保藏时，保藏效果良好，不仅存活率高，且能连续传至7代，生产稳定性好。