过氧化氢处理的小牛葡萄球菌发色剂及其制备方法和应用

本发明属于肉品科学，尤其涉及一种过氧化氢处理的小牛葡萄球菌发色剂及其制备方法和应用、提高小牛葡萄球菌呈色能力的方法、肉品发色方法。

背景技术：

1、亚硝酸盐作为一种十分常见的食品添加剂，具有改善肉制品色泽等多重作用，发酵香肠的颜色形成通常依赖于亚硝酸盐的添加，它的还原产物一氧化氮(no)与肉中的肌红蛋白相互作用形成亚硝基肌红蛋白，是一种红色色素。然而，因其在腌肉以及人体胃液中都能与氨基酸和二级胺类反应，生成具有致畸、致癌性的n-亚硝胺化合物，引起了人们的极大担忧，因此减少其在肉制品中的使用，提高肉制品的安全性迫在眉睫，寻找其功能替代方法至关重要。

2、在众多亚硝酸盐发色作用的替代方法中，微生物发酵法具有巨大潜力。cn110800913a公开了一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂。其中的一种发色剂为凝固酶阴性葡萄球菌的菌粉剂或菌悬液，使用时在肉制品加工中的接种量为106～107cfu/g肉。另一种发色剂由凝固酶阴性葡萄球菌的菌粉剂或菌悬液和l-精氨酸组成。使用时，凝固酶阴性葡萄球菌在肉制品加工中的接种量为106～107cfu/g肉，l-精氨酸在肉制品加工中的添加量为其质量的0.6～1.2％。所述菌粉剂或菌悬液由凝固酶阴性葡萄球菌通过液体培养基培养制得。cn110800913a通过使用具有一氧化氮合酶的凝固酶阴性葡萄球菌，可以在加工肉制品中产生no，从而形成红色的亚硝基肌红蛋白，使加工肉制品呈现红色泽；同时添加l-精氨酸为一氧化氮合酶提供底物，可以进一步提升红色泽。然而，由于一氧化氮合酶在凝固酶阴性葡萄球菌中的低表达，其发色作用普遍弱于亚硝酸盐。

3、cn114568644a公开了一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法。该方法通过低强度高静水压处理接种凝固酶阴性葡萄球菌后的发酵香肠，并经过发酵，使香肠成品的红度值达到6.5～7.0。使用时，凝固酶阴性葡萄球菌在香肠肉中的接种量为106～107cfu/g肉；高静水压处理压力为200～300mpa，处理时间为3～7min。低强度的高静水压处理通过提高凝固酶阴性葡萄球菌中一氧化氮合酶的表达量进而促进发酵香肠中亚硝基肌红蛋白的产量，提升发酵香肠色泽。该加工方法能提升发酵香肠的色泽，为亚硝酸盐在发酵香肠中的发色替代提供了一个可行的方案，满足了人们对于健康、安全的发酵香肠产品的需求。但由于高静水压会引起食品体积的缩小，因此这种技术只适应于软包装食品，并且，高静水压技术的不能一次性处理大量的原料，成本很高，因此商业化产品中超高压多用在处理高端产品上，例如海鲜、珍果等。

4、因此，为进一步提高小牛葡萄球菌在发酵香肠中的呈色能力，扩大其使用范围，增加使用便利性，有必要寻找新的食品级处理方法来提高小牛葡萄球菌一氧化氮合酶的表达量与酶活性，并应用于发酵肉制品中。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种过氧化氢处理的小牛葡萄球菌发色剂及其制备方法和应用、肉品发色方法，为了代替潜在危害物亚硝酸盐在发酵香肠中的发色应用，提高发酵香肠产品安全性。

2、为解决上述全部或部分技术问题，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面在于提供过氧化氢处理的小牛葡萄球菌发色剂，所述发色剂包括经过氧化氢处理过的小牛葡萄球菌。

4、过氧化氢能够氧化含有sh基的酶，使这些酶失去活性，从而干扰细菌的代谢，造成细胞分裂和繁殖的障碍。所以，过氧化氢可用于室内空气消毒和对于一般物体表面的预防性消毒，但并没有广泛应用到食品领域中。进一步地，由于过氧化氢作为灭酶手段的认知，技术人员对过氧化氢形成了技术偏见，并不能够将其应用于肉制品发色的技术领域中来。小牛葡萄球菌悬液直接使用时，对肉制品的发色具有一定效果，但不如添加亚硝酸盐的发色效果。然而，本发明人发现所述经过氧化氢处理后的小牛葡萄球菌悬液中一氧化氮合酶的活性显著升高，将其应用于肉制品，能够更为有效地提升肉制品的红度值，达成与亚硝酸钠相当的发色效果。

5、在部分实施例中，所述过氧化氢处理过的小牛葡萄球菌是由含有小牛葡萄球菌与40～60mm过氧化氢的液相混合体系在30～42℃温度条件下处理10～20min得到的。在合适的温度、处理时间条件下，一定浓度的过氧化氢处理能够在保证小牛葡萄球菌的存活率的前提下，提高小牛葡萄球菌一氧化氮合酶的酶活性，从而提高小牛葡萄球菌的呈色能力。若过氧化氢浓度过低，则会导致小牛葡萄球菌氧化应激程度不强进而限制了一氧化氮合酶活性的提高，若过氧化氢浓度过高，则会导致小牛葡萄球菌存活较少进而一氧化氮合酶活性丧失。

6、在部分实施例中，所述发色剂包括小牛葡萄球菌悬液，所述小牛葡萄球菌悬液中经过氧化氢处理过的小牛葡萄球菌的浓度为108～109cfu/ml。

7、本发明的第二方面在于提供小牛葡萄球菌发色剂的制备方法，包括：

8、将小牛葡萄球菌与过氧化氢混合形成液相混合体系，所述液相混合体系中过氧化氢的浓度为40～60mm；

9、将所述液相混合体系置于30～42℃的温度条件下并维持10～20min，之后从所述液相混合体系中分离出经过氧化氢处理过的小牛葡萄球菌，经洗涤、重悬后获得经过氧化氢处理过的小牛葡萄球菌悬液，即所述发色剂。

10、本发明的第三方面在于提供一种提高小牛葡萄球菌呈色能力的方法，包括：

11、将小牛葡萄球菌悬液与过氧化氢溶液混合形成混合体系，所述混合体系中过氧化氢的浓度为40～60mm；

12、将所述混合体系置于30～42℃的温度条件下并维持10～20min，得到过氧化氢处理的小牛葡萄球菌悬液。

13、在部分实施例中，所述小牛葡萄球菌悬液的浓度为108～109cfu/ml。

14、在部分实施例中，所述过氧化氢溶液的浓度为8～12mol/l。

15、在部分实施例中，所述方法包括：对得到的过氧化氢处理的小牛葡萄球菌悬液进行后处理，所述后处理包括：对所述过氧化氢处理的小牛葡萄球菌悬液进行固液分离，得到第一菌体沉淀，然后对所述第一菌体沉淀进行洗涤和重悬。

16、进一步的，所述固液分离包括：使过氧化氢处理的小牛葡萄球菌悬液于0～4℃条件下以10000～12000g转速离心5～8min，去除上清液，获得第一菌体沉淀。

17、进一步的，采用无菌生理盐水进行所述洗涤。

18、在一个典型实施例中，所述提高小牛葡萄球菌呈色能力的方法，包括以下步骤：

19、在1～2ml小牛葡萄球菌菌悬液加入8～12mol/l过氧化氢溶液，使其浓度为40～60mm，在30～42℃处理10～20min，获得过氧化氢处理的菌悬液；

20、将获得的过氧化氢处理的菌悬液于0～4℃条件下以10000～12000g转速离心5～8min，去上清，获得第一菌体沉淀；

21、用1～2ml无菌生理盐水将所得的第一菌体沉淀洗涤2～3次并重悬，获得所述过氧化氢处理的小牛葡萄球菌悬液。

22、在部分实施例中，所述小牛葡萄球菌菌悬液的制备方法包括：

23、将小牛葡萄球菌菌泥接入第一scb培养基中，均匀混合后以150～250rpm的速度在36～38℃的温度条件下振荡培养18～20h，获得一代菌；

24、将所述一代菌接入第二scb培养基中，接种浓度为106～107cfu/ml，均匀混合后以150～250rpm速度在36～38℃温度条件下振荡培养18～20h，获得二代菌；

25、将所述二代菌接种至第三scb培养基中，接种浓度为106～107cfu/ml，均匀混合后以150～250rpm速度在36～38℃温度条件下振荡培养18～20h，获得三代菌；

26、对所述三代菌进行固液分离获得第二菌体沉淀，然后对所述第二菌体沉淀进行洗涤并重悬，得到小牛葡萄球菌悬液。

27、进一步的，将三代菌于10000～12000g、0～4℃条件下离心5～8min，去上清，获得第二菌体沉淀；然后用10ml无菌生理盐水将菌体沉淀洗涤3～5次并重悬，获得108～109cfu/ml的小牛葡萄球菌悬液。

28、本发明的第四方面提供上述任一项技术方案所述的发色剂在肉制品发色中的应用。

29、在部分实施例中，所述的肉制品包括但不限于调理肉糜、香肠、发酵香肠、腊肠、色拉米、肉脯等。

30、本发明的第五方面提供一种肉品发色方法，包括：使上述任一项发色剂与待发色肉制品均匀混合发酵，得到发酵肉制品。

31、在部分实施例中，所述发色剂的加入量为106～108cfu/g肉。

32、在部分实施例中，所述肉品发色方法具体包括：使上述任一项发色剂与待发色肉糜和辅料均匀混合，得到调制肉糜，然后采用肠衣进行灌制，得到香肠；使所述香肠风干并进行发酵，得到发酵香肠。

33、进一步的，以100重量份的待发色肉糜为基准，所述辅料包括0.5～5.0重量份的氯化钠和0.5～10重量份的葡萄糖。

34、进一步的，所述风干的条件包括：使所述香肠在温度23～27℃、湿度40～50％的条件下风干1～2d。

35、进一步的，所述发酵的条件包括：将风干得到的肉制品置于温度23～27℃、湿度75～80％的条件下发酵6～8d。

36、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

37、(1)本发明将所述小牛葡萄球菌悬液经过氧化氢处理后，能显著提高一氧化氮合酶的酶活性。其原因在于，一定程度的过氧化氢处理会对微生物产生氧化胁迫，促使其产生氧化应激反应，菌株相应抗氧化酶的表达将被上调。一氧化氮合酶是细菌抵抗氧化应激的一种重要的抗氧化酶，一定程度的过氧化氢处理使一氧化氮合酶的过量表达，提升了其酶活性。

38、(2)本发明提供的一定浓度的过氧化氢处理对小牛葡萄球菌的存活率影响极小，保留了小牛葡萄球菌作为发酵剂的作用，为通过诱导一氧化氮合酶表达提升微生物促发酵香肠呈色能力提供了可行的方案。

39、(3)本发明中，将小牛葡萄球菌悬液经过氧化氢处理后，能显著提高发色效果，不仅优于直接使用小牛葡萄球菌悬液，还可达到添加亚硝酸盐的发色效果；这是由于一定程度的过氧化氢处理使一氧化氮合酶的酶活性提高，进而提升了no产量，促进了香肠中亚硝基肌红蛋白的形成，从而使香肠产生更好的红色泽。

40、(4)本发明为降低肉制品中亚硝酸盐的添加及探究发酵肉制品中亚硝基肌红蛋白形成的替代方法提供了一种实用的解决方案，有利于打造绿色食品，促进食品安全。