一种合成D-泛解酸内酯的方法与流程

本发明属于生物催化领域，主要涉及一种合成d-泛解酸内酯的方法。

背景技术：

1、d-泛解酸内酯(d pantolactone，d-pl)是合成d-泛酸、泛酸钙(维生素b5)及泛醇的关键手性前体，广泛应用于医药、食品、饲料添加剂和化妆品等行业。其中d-泛酸在动物体中是合成辅酶a的中间代谢物，参与脂肪酸、蛋白质和脂质的多种代谢反应。

2、工业上合成d-泛解酸内酯主要通过化学合成和水解酶酶拆分的方法。先通过异丁醛和甲醛缩合反应，再在酸性条件下与氰化氢加成反应生成外消旋的dl-泛解酸内酯。dl-泛解酸内酯经d-泛解酸内酯水解酶水解成l-泛解酸内酯成d-泛解酸，其中d-泛解酸经酸处理可内酯化形成d-泛解酸内酯，l-泛解酸内酯经消旋之后可以继续回收套用。这套工艺虽然相对成熟，但是存在流程繁杂，试剂用量大，环境污染严重等缺陷，同时因为不可避免的需要使用氰化氢，给生产上带来了一定的安全成本。

3、基于化学法合成d-泛解酸内酯工艺的缺陷，研究人员倾向于讨论氧化还原酶法在工业上的应用。该方法中的关键是两种酶：l-泛解酸内酯脱氢酶和酮基泛解酸内酯还原酶。首先l-泛解酸内酯脱氢酶催化l-泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯，接着其在酮基泛解酸内酯还原酶作用下还原为d-泛解酸内酯，由于该酶反应过程中需要辅因子参与，因此需同时引入葡萄糖脱氢酶和葡萄糖推动辅因子的再生循环。该方法工艺流程简单，反应条件温和，同时避免了有毒试剂的使用。然而目前氧化还原酶生产d-泛解酸内酯的工艺开发尚不成熟，且受限于l-泛解酸内酯脱氢酶和酮基泛解酸内酯还原酶的活力限制，多酶催化反应的效率较低且容易造成中间产物的积累。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是克服现有技术中生产d-泛解酸内酯多酶催化反应的效率较低且容易造成中间产物的积累的问题，提供了一种合成d-泛解酸内酯的方法。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

3、本发明的第一方面提供一种合成d-泛解酸内酯的方法，利用基因工程菌或基因工程菌组合催化dl-泛解酸内酯合成d-泛解酸内酯；

4、所述基因工程菌或基因工程菌组合包括编码l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶和酮泛解酸还原酶的核苷酸序列的重组载体；编码所述核苷酸序列在同一载体或分开的载体上。

5、本发明一些实施方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶选自聚集红球菌(rhodococcusfascians)、所述酮泛解酸内酯还原酶选自长孢洛德酵母(lodderomyces elongisporus)、所述葡萄糖脱氢酶选自微小杆菌(exiguobacterium sibiricum)、所述酮泛解酸还原酶选自大肠杆菌(e.coli)。

6、本发明一些较佳实施方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶的氨基酸序列如seq idno:5所示、所述酮泛解酸内酯还原酶的氨基酸序列如seq id no:6所示、所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:7所示、所述酮泛解酸还原酶的氨基酸序列如seq id no:8所示。

7、本发明一些实施方案中，所述基因工程菌包括第一载体、第二载体和第三载体，其中，所述第一载体包括编码l-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列，第二载体包括编码酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列，第三载体包括编码葡萄糖脱氢酶和酮泛解酸还原酶的核苷酸序列。

8、本发明一些实施方案中，所述基因工程菌组合包括第一基因工程菌和第二基因工程菌，所述第一基因工程菌包含第一载体和第二载体，所述第二基因工程菌包含第三载体；其中第一载体包括编码l-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列，第二载体包括编码酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列，第三载体包括编码葡萄糖脱氢酶和酮泛解酸还原酶的核苷酸序列。

9、本发明一些实施方案中，编码所述l-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如seq idno:1所示、编码所述酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如seq id no:2所示、编码所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如seq id no:3所示、编码所述酮泛解酸还原酶的核苷酸序列如seqid no:4所示。

10、本发明一些实施方案中，所述第一载体的骨架质粒为pet21a，所述第二载体的骨架质粒为prsfduet-1，所述第三载体的骨架质粒为pacycduet-1。

11、本发明一些实施方案中，所述方法还包括加入葡萄糖。

12、本发明一些较佳实施方案中，将所述基因工程菌或基因工程菌组合发酵，以发酵液的形式加入催化dl-泛解酸内酯。

13、本发明一些具体实施方案中，发酵结束后先取样通过离心称重的方式测定单位体积发酵液中菌体湿重，再根据反应体系中基因工程菌或基因工程菌组合的细胞用量计算并加入对应体积的发酵液。

14、本发明一些实施方案中，所述细胞用量为20-200g/l，所述dl-泛解酸内酯浓度为0.5m-2m，所述葡萄糖摩尔浓度为dl-泛解酸内酯摩尔浓度的0.5-2倍。

15、本发明一些较佳实施方案中，所述催化的条件包括以下一种或多种：反应温度20-40℃；搅拌转速100-800rpm例如300-700rpm；100mm pbs缓冲液ph 5.5-7.5条件下反应20-40h。

16、本发明一些具体实施方案中，所述细胞用量50g/l、dl-泛解酸内酯1.5m、葡萄糖0.9m、ph6.5、反应温度35℃、反应转速600rpm、反应时间36h。

17、本发明一些实施方案中，所述发酵的步骤包括：将基因工程菌接种至发酵培养基中培养，随后加入补料培养基继续培养。

18、本发明一些较佳实施方案中，所述发酵的条件选自以下一种或多种：

19、接种量为5-15％；温度37℃；转速500rpm；培养时间为7-9h。

20、本发明一些实施方案中，在接种至发酵培养基前还包括种子培养。

21、本发明一些较佳实施方案中，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养。

22、本发明一些具体实施方案中，所述一级种子培养的培养基为lb培养基。

23、本发明一些具体实施方案中，所述二级种子培养的培养基为tb培养基。

24、本发明一些具体实施方案中，所述一级种子培养的条件选自以下一种或多种：

25、接种量为1-5％；温度37℃；转速200rpm；培养时间为12-36h。

26、本发明一些具体实施方案中，所述二级种子培养的条件选自以下一种或多种：

27、接种量为5-15％；温度37℃；转速200rpm；培养时间为4-8h。

28、本发明一些实施方案中，所述发酵培养基包括：葡萄糖5-15g，蛋白胨5-15g，酵母浸粉5-15g，磷酸二氢钾5-15g，磷酸氢二钾5-15g，硫酸镁0.25-1g，氯化铵1-5g，氨苄青霉素50-150mg，卡那霉素25-75mg，氯霉素15-35mg。

29、本发明一些实施方案中，所述补料培养基包括：葡萄糖400-800g、蛋白胨40-80g、酵母浸粉20-60g、硫酸镁2.5-7.5g。

30、本发明一些具体实施方案中，每升发酵培养基包括：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸粉7g、磷酸二氢钾5g、磷酸氢二钾12.5g、硫酸镁0.5g、氯化铵3g、氨苄青霉素100mg、卡那霉素50mg，氯霉素25mg。

31、本发明一些具体实施方案中，每升补料培养基包括：葡萄糖600g、蛋白胨60g、酵母浸粉40g、硫酸镁5g。

32、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

33、本发明所用试剂和原料均市售可得。

34、本发明的积极进步效果在于：

35、本发明提供了一种重组工程菌的发酵方法和多酶催化合成d-泛解酸内酯的方法，能够在高浓度底物条件下显著提高反应效率、显著降低中间产物的积累，提高产品转化率。用于高效制备光学纯度高的d-泛解酸内酯，具有操作简便、绿色环保，适宜工业化生产等优点。