一种融合核酸外切酶的CRISPR/Cas12i基因编辑衍生系统及其应用

本发明属于基因编辑，涉及一种采用核酸外切酶t5exo与核酸内切酶hfcas12max融合策略的crispr/cas12i基因编辑衍生系统的构建与应用。

背景技术：

1、crispr/cas是一种原核生物中rna介导的可以识别并分解异源的遗传物质的获得性免疫防御系统，在古菌和细菌中广泛存在。crispr是成簇的有规律间隔的回文重复序列，cas是crispr核酸酶蛋白。crispr/cas免疫防御系统被分为3种类型，即typeⅰ型、typeⅱ型和typeⅲ型。在这三个类型当中，ⅱ型crispr系统crispr/cas9是目前为止研究及应用最为广泛的系统。在crispr/cas9基因编辑系统中，向导rna(guide rna,grna)替代了之前技术中的crrna以及tracrrna的作用，其可以在grna的作用下识别靶序列的原型间隔区相邻基序，也就是pam位点，然后引导核酸酶cas9切割靶位点，并利用非同源末端连接或者同源重组的修复方式，实现对基因的敲除和修饰等编辑结果。

2、随着基于crispr/cas的第三代基因编辑技术的广泛应用，为提高其编辑效率，一些改进的系统也被提出，例如中国专利cn116615226a、cn116769754a中引入了可以切割和改变核苷酸链结构的核酸外切酶与crispr核酸酶蛋白进行融合。其中cn116769754a利用linker将t5核酸外切酶(按照5’至3’方向降解单链或双链dna)与已有的cas12i3融合，并引入了核定位信号(即nls)序列以构建表达载体，但经其改造后的cas12i3蛋白在所有编辑位点的编辑效率均未达到30％，并且编辑效率仅限于细胞水平的统计结果，没有关于动物胚胎及相应出生后个体的编辑效率的考察。因此，通过融合t5核酸外切酶开发能够在基因功能研究、基因治疗，尤其是动植物生物育种领域得到广泛应用的crispr/cas12i基因编辑衍生系统受到其基因编辑效率的制约。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题与不足，本发明提供了一种融合核酸外切酶的crispr/cas12i基因编辑衍生系统及其应用。

2、为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：

3、一种核酸内切酶衍生蛋白基因，包括经连接序列串联的用于编码核酸外切酶的基因序列与用于编码cas12i的基因序列，所述cas12i为cas蛋白hfcas12max(用于编码hfcas12max的基因序列如seq.id.no.1所示)。

4、一种crispr/cas12i编辑工具，该编辑工具包括用于融合表达核酸外切酶与cas12i的基因元件，所述cas12i为上述hfcas12max。

5、优选的，所述编辑工具还包括crrna表达元件。

6、优选的，所述基因元件具体包括依次排列的ii型启动子(如cbh启动子等)、上游核定位信号序列、上述cas12i的基因序列(即上述seq.id.no.1)、上述连接序列、上述核酸外切酶的基因序列、下游核定位信号序列和polya终止序列，crrna表达元件具体包括依次排列的iii型启动子(如u6启动子等)和crrna导向及骨架序列。

7、优选的，所述crrna导向及骨架序列包括可特异性靶向目标基因组区域中特定靶序列(如拟编辑目标基因上的靶位点等任意一编辑位点)的向导rna(grna)。

8、优选的，所述编辑工具还包括荧光报告基因表达元件和/或抗性基因表达元件。

9、优选的，所述基因元件和crrna表达元件构建在一个共表达载体骨架上，或者所述基因元件和crrna表达元件分别构建在两个表达载体骨架上。

10、优选的，所述编辑工具还包括供体载体，供体载体包括用于在编辑位点插入的外源性核酸片段或内源性核酸片段。

11、优选的，所述荧光报告基因表达元件、抗性基因表达元件可以集成在供体载体上，也可以集成在含有所述基因元件和/或crrna表达元件的载体上。

12、优选的，所述连接序列(具体为xten序列)如seq.id.no.2所示。

13、优选的，所述核酸外切酶(具体为t5核酸外切酶)的基因序列如seq.id.no.3所示。

14、优选的，所述上游核定位信号(具体为sv40 nls)序列、下游核定位信号(具体为nucleoplasmin nls)序列分别如seq.id.no.4、seq.id.no.5所示。

15、一种基因编辑方法，包括以下步骤：

16、s1载体构建

17、针对目标基因组区域中特定靶序列，设计相应的grna；构建含有上述crrna表达元件的载体以及含有用于融合表达核酸外切酶(如t5核酸外切酶)与cas12i的基因元件的载体，或者构建集成上述crrna表达元件与所述基因元件的载体；所述cas12i为上述hfcas12max；

18、s2载体导入

19、将构建的载体通过阳离子聚合物转染试剂或电穿孔的方式转染进目标细胞。

20、优选的，所述基因编辑方法还包括以下步骤：

21、s3检测

22、通过流式分选或药物筛选获得相应的转染阳性细胞。

23、优选的，所述转染的目标细胞为hek293t细胞、hela细胞、u2os细胞、绵羊胎儿成纤维细胞、绵羊肌肉细胞。

24、另一种基因编辑方法，包括以下步骤：

25、s1针对目标基因组区域中特定靶序列，设计相应的grna，然后通过直接合成或体外转录制备相应的crrna样品(如上述crrna表达元件中的crrna导向及骨架序列的转录产物)；

26、s2将crrna样品与核酸外切酶-cas12i融合蛋白的体外表达产物(如表达的相应mrna)，通过显微注射导入目标细胞，所述核酸外切酶-cas12i融合蛋白是通过预先将经上述连接序列串联的用于编码核酸外切酶(如t5核酸外切酶)的基因序列与用于编码cas12i的基因序列进行融合表达所得，所述cas12i为上述hfcas12max。

27、优选的，所述基因编辑方法还包括以下步骤：

28、s3筛选显微注射后存活的细胞，即可获得相应的基因编辑细胞。

29、优选的，所述显微注射的目标细胞为动物(如绵羊)的体外受精胚胎或核移植胚胎。

30、一种提高特异性核酸内切酶介导的基因编辑效率的方法，包括以下步骤：

31、在特异性核酸内切酶的n端通过串联表达的上述连接序列融合核酸外切酶(如通过xten连接t5核酸外切酶)，或者在特异性核酸内切酶的c端通过串联表达的上述连接序列融合核酸外切酶(如通过xten连接t5核酸外切酶)，所述特异性核酸内切酶为上述hfcas12max。

32、上述提高特异性核酸内切酶介导的基因编辑效率的方法在羊生物育种中的应用。

33、本发明的有益效果体现在：

34、本发明通过筛选与核酸外切酶(如t5核酸外切酶)融合的cas酶(具体为hfcas12max)，提出了融合核酸外切酶的crispr/cas12i基因编辑衍生系统(如crispr/cas12i-t5exo基因编辑系统)，提高了cas酶介导的基因编辑的效率，在动物遗传育种等方面具有较好的应用价值和前景。