一种高通量筛选sgRNA骨架活性突变体的系统及方法

：本发明提供了一种高通量快速筛选sgrna骨架(sgrnascaffold)活性突变体序列的系统和方法，属于生物工程。

背景技术

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背景技术：

1、基于crispr系统的基因编辑技术是生命科学领域最前沿的技术之一。在生命科学研究领域，该技术已经广泛用于生命技术的开发以及医疗研发；在工业技术领域，该技术通常应用于底盘细胞基因组的改造，代谢流的重塑，副产物的消除，以及目标产物产量的提升。

2、crispr/cas9系统包含两个重要元件，即cas9蛋白以及sgrna scaffold(sgrna骨架)。最初的crispr/cas9系统包括两条rna序列，分别是与n20相连的crrna以及可以与crrna互补配对的tracrrna。2012年doudna等对crrna与tracrrna进行优化后，将两条rna序列改造成为一条长的sgrna骨架。sgrna骨架是目前crispr/cas9系统中重要的元件之一，该元件和与靶点互补的n20序列共同组成具有活性的向导rna(sgrna)后，引导cas9蛋白靶向特异性dna序列，形成三元复合体，实现crispr系统对特定基因的识别和切割，从而产生dna双链断裂(double strand breaks，dsbs)。细胞内存在两种内源dna修复系统，一种是在dna序列上产生随机插入或缺失而使基因失活的非同源末端连接系统(non-homologous endjoining，nhej)，另一种是依赖同源序列实现靶位点dna片段精确替换或敲入的同源重组修复系统(homology directed repair，hdr)。

3、基于crispr/cas9的基因编辑系统是一种强大的基因操作工具，其对dna的识别与切割依赖于向导rna(sgrna)的活性。使用crispr/cas9系统同时靶向多个位点，可以进一步扩大基因编辑系统的效率和应用场景，减少时间以及人工成本。理论上，通过串联表达多个相同的sgrna骨架，可以靶向不同的基因，使多个基因同时失活。但是，在构建载体的过程中，相同的sgrna骨架序列之间会发生同源重组，导致载体构建失败，即便构建成功，这些序列也很难在细胞内同时稳定地表达，极大限制了crispr基因组编辑工具的应用范围。为了避免构建过程中sgrna序列的缺失，目前已开发了多种重复片段组装的方法，但仍未从根本上解决该问题。因此，提供多样化的sgrna骨架序列，有助于拓展crispr基因组编辑元件和工具，推动多基因敲除/插入、多基因转录调控等重要技术手段的完善。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、针对sgrna 骨架(sgrna scaffold)序列缺乏、串联重复表达易缺失、不稳定的缺点，本发明将提供一种高通量筛选sgrna骨架活性突变体序列的系统和方法，所述系统利用cas蛋白的切割能力以及菌株的重组能力，筛选出有活性的sgrna骨架序列突变体。所述系统和方法可以应用于crispr基因编辑系统sgrna骨架元件的筛选，利用本方法，能够得到序列多样的sgrna骨架，进而应用于多靶点基因编辑、菌株库的构建等领域，拓展crispr基因编辑系统的应用领域和编辑效率。

2、为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供的技术方案之一，是一种sgrna骨架活性突变体筛选系统，所述系统包含cas蛋白表达载体和sgrna骨架突变体筛选载体；

4、所述cas蛋白表达载体上包含以下表达元件：cas蛋白编码基因、质粒复制子、以及第一抗性筛选标签表达盒；所述sgrna骨架突变体筛选载体包含以下表达元件：质粒复制子、第二抗性筛选标签表达盒、第三筛选标签表达盒、用于表达sgrna骨架序列的启动子和终止子；

5、进一步地，cas蛋白表达载体上，所述cas蛋白编码基因可以是野生型cas9(spcas9)的编码基因，也可以是spcas9的变体，如spg，spry，superfi-cas9等；优选地，所述cas蛋白编码基因为seq id no.1所示的spcas9；

6、进一步地，cas蛋白表达载体上，所述质粒复制子用于调控所述cas蛋白表达载体在细胞中的复制，任意具有上述功能的复制子均可用于本发明，包括但不限于pbr322，puc，p15a，colei，pmb1，psc101等复制子，在本发明中优选如seq id no.2所示的p15a复制子；

7、进一步地，cas蛋白表达载体上，所述第一抗性筛选标签表达盒包含第一抗性筛选标签，所述第一抗性筛选标签可以是任意抗性基因，包括但不限于氨苄青霉素，壮观霉素，氯霉素，卡那霉素，四环素等抗性基因等，在本发明中优选氯霉素抗性基因；所述第一抗性筛选标签表达盒上还包含用于表达第一抗性筛选标签的启动子、终止子等元件；所述第一抗性筛选标签表达盒用于cas蛋白表达载体构建过程中的筛选和含有该载体的细胞筛选；

8、优选地，构建包含p15a复制子、seq id no.1所示的spcas9编码基因和氯霉素抗性(cmr)编码基因的cas蛋白表达载体pvcas-pre，核苷酸序列如seq id no.3所示；

9、进一步地，sgrna骨架突变体筛选载体上，所述复制子用于调控所述sgrna骨架突变体筛选载体在细胞中的复制，任意具有上述功能的复制子均可用于本发明，包括但不限于pbr322,puc,p15a,colei，pmb1，psc101等复制子；所述复制子与cas蛋白表达载体中的复制子兼容；在本发明中优选如seq id no.4所示的pbr322复制子；

10、进一步地，sgrna骨架突变体筛选载体上，所述第二抗性筛选标签表达盒包含第二抗性筛选标签，可以是任意不同于cas蛋白表达载体中的第一抗性筛选标签的抗性基因，所述第二抗性筛选标签表达盒用于sgrna骨架突变体筛选载体构建过程中的筛选以及最终含有该载体的细胞筛选；所述第三筛选标签表达盒包含第三筛选标记基因，所述第三筛选标记包括但不限于荧光信号标记，颜色信号标记等；所述第二抗性筛选标签表达盒上还包含用于表达第二抗性筛选标签的启动子、终止子等元件；所述第三筛选标签表达盒上还包含用于表达第三筛选标记基因的启动子、终止子等元件；

11、进一步地，所述荧光信号标记包括但不限于：绿色荧光信号标记、红色荧光信号标记、蓝色荧光信号标记、黄色荧光信号标记、青色荧光信号标记等；可使用流式细胞仪，微液滴分选仪进行检测与分选；

12、进一步地，所述颜色信号标记包括但不限于：meffred,eforred,aspink,spispink,scorange,fwyellow,amilgfp,amajlime,cjblue,meffblue,aeblue,amilcp,tspurple，gfaspurple等，可在可见光下通过颜色比对进行检测与分选；

13、更进一步地，采用荧光信号标记实现sgrna骨架突变体的高通量筛选；

14、更进一步地，第三筛选标记基因中加入一段插入序列使其失活，所述插入序列包含可被识别的23bp外源序列以及与第三筛选标记插入位点上游的同源序列；所述插入位点是指23bp外源序列在第三筛选标记基因上的插入位点，该位点可以是插入后能够使第三筛选标记基因失活的任意位点；所述23bp外源序列包含20bp识别序列和3bp pam，所述识别序列可以是任意被crispr/cas9高效识别的外源序列；所述pam为原间隔序列临近基序，是紧邻原间隔序列5'端或3'端的保守序列，如ngg，所述“n”可以是a、t、c、g中的任意一种；

15、进一步地，sgrna骨架突变体筛选载体上，所述用于表达sgrna骨架序列的启动子和终止子可以任选本领域的常用启动子和终止子，包括但不限于j23119,j23110,j23101,j23100,j23102；t1,t2,tf,ttrpa等，在本发明中优选如seq id no.5所示的启动子j23119与seq id no.6所示的终止子t1。

16、本发明提供的技术方案之二，是一种sgrna骨架突变文库的构建方法，以技术方案一所述sgrna骨架突变体筛选载体为模版，通过设计突变引物在所述模版上引入61nt的sgrna骨架突变体序列和n20序列，从而构建突变文库，所述sgrna骨架突变体序列可以是在seq id no.8所示61nt野生型sgrna骨架序列的dna序列上任意位点发生突变的序列；所述n20序列与第三筛选标记基因中插入的20bp识别序列一致；

17、进一步地，所述突变引物上包含已引入突变位点的61nt的sgrna骨架突变体序列和n20序列；

18、进一步地，所述突变引物上包含与所述sgrna骨架突变体筛选载体的同源序列，用于通过同源重组的方式在筛选载体上引入sgrna骨架突变体序列和n20序列；

19、进一步地，所述61nt的sgrna骨架突变体序列是以野生型sgrna骨架序列的dna序列为基础，将突变区域的碱基设置为n，所述n可以是a、t、c、g中的任意一种，不需要突变的区域与野生型sgrna骨架序列的dna序列相同；

20、更进一步地，将61nt的sgrna骨架划分为4个区域，对上述4个区域中的至少1个进行突变，从而构建突变文库；其中，

21、区域1为sgrna骨架的1-6nt，9-12nt，17-20n与25-30nt部分；

22、区域2为sgrna骨架的7-8nt，13-16nt与21-24nt部分；

23、区域3为sgrna骨架的33-41nt与49-60nt部分；

24、区域4为sgrna骨架的31-32nt，42-48nt与61nt部分；

25、更进一步地，将上述4个区域分别突变获得的突变体进行组合，获得2个或3个或4个区域同时发生突变的突变文库。

26、本发明提供的技术方案之三，是由技术方案之二所述方法构建的sgrna骨架突变文库。

27、本发明提供的技术方案之四，是一种sgrna骨架活性突变体的筛选方法，所述方法是将技术方案之一构建的cas蛋白表达载体和技术方案之三构建的sgrna骨架突变文库分别转化至大肠杆菌中，将经过第三筛选标记信号特征筛选后的细胞经过复苏，将分选的细胞培养在含有第二抗性筛选标签的培养基上，正常生长且具有相对应第三筛选标记信号特征的菌株中所含有的sgrna骨架突变体序列即为有活性的sgrna骨架突变体；

28、进一步地，将技术方案之一构建的cas蛋白表达载体和技术方案之三构建的sgrna骨架突变文库分别转化至大肠杆菌中，经过facs或微液滴分选仪分选具有荧光信号的细胞后，经过复苏，将分选的细胞培养在含有第二抗性筛选标签的培养基上进行培养，正常生长且能产生相对荧光的菌株中所含有的sgrna骨架突变体序列即为有活性的sgrna骨架突变体；并以此实现高通量筛选；

29、进一步地，将技术方案之一构建的cas蛋白表达载体和技术方案之三构建的sgrna骨架突变文库分别转化至大肠杆菌中，经过可见光下的颜色比对分选出具有颜色信号的细胞后，经过复苏，将分选的细胞培养在含有第二抗性筛选标签的培养基上进行培养，正常生长且具有相对应颜色的菌落中所含有的sgrna骨架突变体序列即为有活性的sgrna骨架突变体。

30、本发明提供的技术方案之五，是由技术方案之四所述方法筛选出的sgrna骨架突变体；

31、进一步地，所述sgrna骨架突变体的dna序列包括但不限于如下序列：

32、sgrnam2-1：gttttaaagctacaactagcgatgtaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg

33、sgrnam2-2：gttttagagctagaggtagcgttgtaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

34、sgrnam2-3：gttttacagctaatagtagcaaagtaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

35、sgrnam2-4：gttttatagctacgaatagctatataaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

36、sgrnam2-5：gttttagggctactactagcttcctaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

37、sgrnam2-6：gttttacggctagccgtagccaagtaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

38、sgrnam2-7：gttttatcgctatgaatagctggttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

39、sgrnam2-8：gttttaatgctatcaatagcaatctaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg；

40、sgrnam4-1：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcctctcggaacttcactaagtg；

41、sgrnam4-2：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgctattaactttttgaagtg；

42、sgrnam4-3：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccggtttgtacttcactaagtg；

43、sgrnam4-4：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgattagaacttatggaagtg；

44、sgrnam4-5：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccagacgtaactttcagaagtg；

45、sgrnam4-6：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcctccttctactttaataagtg；

46、sgrnam4-7：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcccaaactcactttcgcaagtg；

47、sgrnam4-8：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcctagatgcacttcttgaagtg。

48、本发明提供的技术方案之六，是技术方案之五所述sgrna骨架突变体的应用；

49、进一步地，是在crispr/cas9的基因编辑系统中的应用，更进一步地，包括但不限于在碱基编辑、单基因靶点编辑、多基因靶点编辑，如先导编辑、碱基敲除、碱基置换、碱基插入、单基因敲除/插入、多基因敲除/插入、单基因表达梯度调控、多基因转录调控等方面的应用。

50、有益效果：

51、本发明针对sgrna骨架序列缺乏、串联重复表达易缺失、不稳定的缺点，提供一种高通量筛选sgrna骨架活性突变体序列的系统和方法，所述系统利用cas蛋白的切割能力以及菌株的重组能力，筛选出有活性的sgrna骨架序列突变体。所述系统和方法可以应用于crispr基因编辑系统sgrna骨架元件的筛选，利用本方法能够得到序列多样的sgrna骨架，进而应用于多靶点基因编辑、多基因转录调控、菌株库的构建、蛋白质突变库构建等领域，拓展crispr基因编辑系统的应用领域和编辑效率。

52、采用本发明筛选出的多种sgrna骨架序列进行多靶点基因编辑时具有较高的编辑效率。如对大肠杆菌中lac基因的敲除效率最高可达100％，可对大肠杆菌的腺嘌呤碱基进行编辑。