一种基于TaqMan多重探针实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌的方法与流程

本发明涉及布鲁氏菌检测，具体为一种基于taqman多重探针实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌的方法。

背景技术：

1、布鲁氏菌病是一种引起布鲁氏病的革兰氏阴性细菌，是一种严重危害人类和动物健康的病原微生物，布鲁氏菌感染人类、牲畜以及野生动物等可引起临床异常表现和病理变化，如发热、不孕不育、关节炎及神经损害等，尽管已研制出几种预防布鲁氏菌病的疫苗，但其仍然是一个主要的全球健康问题，全世界每年报告的人类布鲁氏菌病病例约为50万例，每年因该病造成的经济损失约30亿美元，由于该病临床症状缺乏特异性，容易慢性化，造成多器官多系统的损伤，严重时可致残，丧失劳动能力，因此早期诊断是控制布鲁氏菌病疫情的重要手段。为了更好地控制和预防布鲁氏病的传播，准确快速地检测和定量布鲁氏菌的数量至关重要，因此，本研究围绕布鲁氏菌的四种关键基因dna oxidativedemethylase alkb(alkb)，abc transporter permease(abctp)，is5-like element is711family transposase(is711)，amino acid abc transporter permease(aaabctp)设计了马耳他布鲁氏菌(brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(brucella suis)、流产布鲁氏菌(brucella abortus)-牛、绵羊附睾布鲁氏菌(brucella ovis)，相应的taqman多重探针实时荧光定量pcr方法，旨在建立一种高效、准确的布鲁氏菌绝对定量方法，在提高临床效率的同时为基础研究奠定相对的研究基础；

2、ba-alkb基因编码一种脂肪酸代谢相关的蛋白，，bo-abctp基因编码一种abc转运蛋白，bm-is711基因是布鲁氏菌特异的插入序列，bs-aaabctp基因编码一种氨基酸abc转运蛋白。这四种基因在布鲁氏菌的生长、代谢和致病机制中起着重要作用，因此选择这些基因作为定量pcr的靶标具有重要的生物学意义；

3、现行国家标准(gb/t18646—2018)中诊断布鲁氏菌病的血清学检测方法主要有试管凝集试验、虎红平板凝集试验、酶联免疫吸附试验、抗人球蛋白试验、补体结合试验等，病原学检查即细菌分离培养，依赖于细菌在实验室培养基上生长和繁殖并形成可见菌落的能力，方法可靠，成本低廉，是诊断布鲁氏菌的“金标准”，但该方法分离率低，需要长达一周的时间来确认，需要专门的设备和专业知识，且存在较大的生物安全风险，taqman多重探针实时荧光定量pcr技术是一种高灵敏度、高特异性的分子生物学方法，能够准确测定目标基因的拷贝数，通过设计特异性的taqman探针，结合pcr扩增和荧光检测技术，可以实现对布鲁氏菌基因的快速、精准定量，相比传统的pcr方法，taqman多重探针实时荧光定量pcr具有更高的准确性和灵敏度，能够有效避免假阳性结果的产生，为布鲁氏菌的绝对定量提供可靠的技术支持；

4、本研究将通过优化pcr反应条件、验证taqman探针的特异性和灵敏度等步骤，建立一种可靠的布鲁氏菌鉴定并分型方法，taqman多重探针实时荧光定量pcr方法是基于使用特定的引物和探针，结合到目标dna序列，并在扩增过程中产生荧光信号，该方法不仅可以用于布鲁氏菌的定量检测，还可以为布鲁氏病的诊断和流行病学调查提供重要的技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于taqman多重探针实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌的方法，解决了背景技术中所提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于taqman多重探针实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌的方法，包括如下方法步骤：

3、步骤一：布鲁氏菌及其他菌株生化鉴定：布鲁氏菌标准株、大肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株、肺炎链球菌标准株、乳酸乳球菌标准株、阴道加德纳菌标准株、幽门螺杆菌标准株、嗜酸乳杆菌标准株、鲍曼不动杆菌标准株经梅里埃全自动细菌鉴定仪vitek-2鉴定；

4、步骤二：引物及探针设计：从genbank查找布鲁氏菌的16s基因(nr_043003.1)和插入元件bm-is711(cp044985.1)、ba-alkb(af148682.1)、bo-abctp(bov_a0503)、bs-aabctp(cs875_04735)的序列，使用beacondesigner7软件设计16s基因鉴定引物及taqman多重探针实时荧光定量pcr检测用的引物和taqman探针，用fam荧光发光基团标记探针的5’端，用bhq淬灭基团标记3’端；

5、步骤三：布鲁氏菌基因组dna提取：布鲁氏菌标准菌株使用液体培养基扩大培养，后将其调整成od值为0.5的菌液，80℃水浴箱灭活15min，使用全自动核酸提取仪ssnp-2000b及配套试剂提取布鲁氏菌dna，使用nanodrop100超微量分光光度计检测浓度及纯度；

6、步骤四：构建阳性质粒：pcr扩增获得布鲁氏菌插入元件ba-alkb、bo-abctp、bm-is711、bs-aaabctp片段，用高保真酶扩增并进行pcr产物纯化，以puc19为骨架载体，将ba-alkb、bo-abctp、bm-is711、bs-aaabctp片段连接到骨架载体上，转入大肠杆菌dh5α进行扩大培养及鉴定，采用超微量分光光度计定量测定提取重组的阳性质粒dna，重组阳性质粒拷贝数利用公式计算得到布鲁氏菌质粒拷贝数为2.97×1010copies/μl，将阳性质粒进行10倍梯度稀释，取10个稀释浓度依次为2.97×1010copies/μl～2.97×100copies/μl，每个稀释浓度均设置3次重复，根据ct值绘制标准曲线，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证；

7、步骤五：taqman多重探针taqman多重探针实时荧光定量pcr检测：采用abi7500荧光定量检测系统进行荧光定量pcr，定量试剂使用premix ex taqtm，按照反应体系计算所需的引物体积，将上游引物和下游引物以一定量进行混合，形成primermix，加样顺序为rnase-free water、mastermix、primer mix、template cdna，加样完成后将反应板放入离心机，离心10sec去除气泡，以及使溶液完全到反应管底部，打开abi7500仪器，设置相对定量反应程序；

8、步骤六：taqman多重探针实时荧光定量pcr敏感性、特异性和重复性检测：

9、灵敏度检测：将四种阳性质粒进行10倍梯度稀释，从2.97×109copies/μl稀释至2.97×100copies/μl，各取2.0μl作为模板使用该taqman多重探针实时荧光定量pcr系统进行检测，以ddh2o为模板作为阴性对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证；

10、特异性检测：以四种阳性质粒以及实验室保存的其他细菌dna(包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乳酸乳球菌、阴道加德纳菌、幽门螺杆菌、嗜酸乳杆菌、鲍曼不动杆菌)作为扩增模板，以ddh2o为模板作为阴性对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证；

11、重复性检测：将阳性质粒进行10倍梯度稀释，从2.97×108copies/μl稀释至2.97×101copies/μl用于计算批间及批内变异系数，将同批次配制的反应体系重复检测3次并计算批内变异系数；其次进行3个不同批次配制的反应体系并计算批间变异系数，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证。

12、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤五中设置的相对定量反应程序如下：

13、1)扩增程序为两步法real-time定量：

14、2)运行程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸以及荧光检测31s，共40个循环，ct值大于35视为阴性。

15、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤四中重组阳性质粒拷贝数计算使用公式如下：

16、

17、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

18、本发明建立的检测方法可对不同种属来源的布鲁氏菌基因组进行特异性检测，对其他细菌无特异性扩增曲线，该检测方法基因拷贝数的检出限为29.7copies/μl，批内变异系数为0.15％～6.69％，批间变异系数为0.21％～4.73％，具有较高的可重复性，采用taqman多重探针实时荧光定量pcr检测临床样本，其灵敏度明显高于血培养检测，可对患者做出准确、及时的诊断。