一种结核分枝杆菌融合蛋白TM及其应用

本发明属于生物医药领域，本发明涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白tm及其应用。

背景技术：

1、结核病(tuberculosis,tb)是通过气溶胶在空气中传播的以结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,m.tb)为病原体的感染病。据世界卫生组织最新出版的防治结核病报告中指出，在2021年，结核病不合并艾滋病毒感染的人群中估计有140万人死亡，而在部分结核病高负担国家中，2021年报告的新诊断结核病人数达到2019年(或更高)水平。有效的诊断方法对于源头上阻断结核分枝杆菌的传播至关重要。目前临床诊断肺结核常用的检测方法有痰涂片抗酸染色、痰培养、t-spot、xpert mtb/rif检测，但涂片染色检出阳性率偏低，培养方法耗时长，t-spot、xpert mtb/rif检测费用昂贵，操作较繁琐，而elisa法具有操作简便、灵敏度高、特异性强、性价比高等特点。

2、tb10.4是由rv0288基因编码是结核分枝杆菌毒力株region of different-1(rd1)编码的免疫显性抗原。通过气溶胶引起的结核分枝杆菌的感染可以在肺中产生大量的tb10.4特异性cd8+和cd4+t细胞，说明tb10.4具有高度的免疫原性。mpt64蛋白是由regionof different-2(rd2)的rv1980c基因编码的免疫原性蛋白。mpt64蛋白含有b细胞抗原决定簇，可诱导机体产生th1型免疫功能为主的免疫应答，也因此成为结核抗体检测的潜在候选抗原组分。rd1、rd2区域在卡介苗传代的阶段丢失，被假设为衰减的原因。因此，rd2编码的mpt64常被选为新型抗结核疫苗开发中的潜在候选抗原。

3、鉴于以上，发明人计划开展对rv0288和rv1980c基因进行重组质粒构建，通过分子克隆方法将目的基因导入pet-30a(+)载体中，构建pet-30a(+)-tb10.4-mpt64重组质粒，并对其进行诱导表达和纯化，得到相应蛋白，并将其命名为tm蛋白(取其蛋白tb10.4和mpt64的首字母缩写)，从而探究其刺激结核分枝杆菌感染人群和健康人群外周血清中抗体的表达水平及差异。

技术实现思路

1、1.本发明提供了一种融合了结核分枝杆菌抗原tb10.4和mpt64新型融合蛋白tm，并提出了该融合蛋白的表达和纯化方法。

2、本发明提供的新型融合蛋白tm可作为抗原包被酶标板，通过制备elisa检测试剂盒，以更加确切的解决现有结核分枝杆菌检测技术中检测操作繁琐、耗时长、费用昂贵的问题。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、结核分枝杆菌融合蛋白tm由结核分枝杆菌抗原tb10.4和mpt64联合构建而成，氨基酸序列为：

5、msdpayninislpsyypdqkslenyiaqtrdkflsaatsstpreapyelnitsatyqsaipprgtqavvlkvyqnaggthptttykafdwdqayrkpitydtlwqadtdplpvvfpivqgelskqtgqqvsiapnagldpvnyqnfavtndgvifffnpgellpeaagptqvlvprsaidsmlaggggsggggssqimynypamlghagdmagyagtlqslgaeiaveqaalqsawqgdtgityqawqaqwnqamedlvrayhamsstheantmammardtaeaakwgg。

6、2.结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的制备方法包括以下步骤：1)结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的构建；2)结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的表达；3)结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的纯化。

7、3.结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的制备方法步骤一具体为：设计tb10.4-mpt64融合蛋白，两个基因之间加linker，翻译成氨基酸序列：

8、msdpayninislpsyypdqkslenyiaqtrdkflsaatsstpreapyelnitsatyqsaipprgtqavvlkvyqnaggthptttykafdwdqayrkpitydtlwqadtdplpvvfpivqgelskqtgqqvsiapnagldpvnyqnfavtndgvifffnpgellpeaagptqvlvprsaidsmlaggggsggggssqimynypamlghagdmagyagtlqslgaeiaveqaalqsawqgdtgityqawqaqwnqamedlvrayhamsstheantmammardtaeaakwgg。

9、下划线为linker

10、将基因优化并合成pet-30a(+)-tb10.4-mpt64，得到pet-30a(+)-tb10.4-mpt64的重组质粒。

11、4.结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的制备方法步骤二为：将构建成功的pet-30a(+)-tb10.4-mpt64重组质粒转入大肠杆菌e.coli bl21感受态细胞用于后期目的蛋白的表达，将表达菌株活化后接种37℃震荡培养过夜，取阳性克隆菌落加入含有卡那霉素的500mllb培养基中37℃震荡培养过夜，加入0.2mmol/l iptg在15℃下震荡培养8h后超声破碎后12000rpm离心10min收取菌体，超声破碎，超声设置50w，30s/30s，45min后收取菌液12000rpm/min离心10min，收集上清液和沉淀分别进行丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳凝胶图通过image lab软件灰度扫描来分析蛋白纯度，设置检测灵敏度50％，融合蛋白tm的纯度大于80％.

12、5.结核分枝杆菌融合蛋白tb10.4-mpt64的制备方法步骤三为：将纯化的融合蛋白tb10.4-mpt64用稀释过的elisa包被液稀释成2μg/ml，每孔100μl，4℃过夜后用5％的bsa溶液封闭酶标板孔，每孔加入200μl，37℃孵育2h。倒掉酶标板孔中液体，将10×pbst稀释后每孔加200μl，3min后倾去酶标板孔中液体，重复5次，将酶标板倒扣在滤纸上拍干。稀释将收集的结核病患者及健康人群血清室温下平衡20分钟后加入pbs稀释成1：100倍。将稀释后的血清每孔加100μl，设置复孔，37℃孵育1h。倒掉酶标板孔中液体，将10×pbst稀释后每孔加200μl，3min后倾去酶标板孔中液体，重复5次，将酶标板倒扣在滤纸上拍干。加入1：3000稀释的hrp标记的羊抗人igg抗体，每孔加100μl，37℃孵育1h。倒掉酶标板孔中液体，将10×pbst稀释后每孔加200μl，3min后倾去酶标板孔中液体，重复5次，将酶标板倒扣在滤纸上拍干。加入100μltmb显色液，避光孵育12min后加入elisa终止液。15分钟以使用空白孔调零后在450nm波长测量各孔吸光度(od值)。

13、本发明的有益效果在于：本发明利用基因工程技术，成功构建表达和纯化了结核分枝杆菌tb10.4-mpt64融合蛋白，并通过亲和层析的方法使该融合蛋白得到了有效的纯化，其可在上清中表达的特性使该融合蛋白作为抗原包被酶标板检测外周血清中的特异性结核分枝杆菌抗体成为可能；本发明通过使用结核分枝杆菌tb10.4-mpt64融合蛋白包被酶标板制备的的elisa抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强、性价比高，易于大规模推广应用。