一种动物肌肉组织细胞核的提取方法及其应用与流程

本发明属于细胞核提取，具体涉及一种动物肌肉组织细胞核的提取方法及其应用。

背景技术：

1、细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的控制中心，也是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一。细胞核在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。尽管细胞核的形状有多种多样，但是它的基本结构却大致相同，主要由核被膜、染色质、核骨架、核仁及核体组成。

2、现有技术中，大多数都是直接制备动物细胞悬液，这是由于动物细胞核中包含染色质、核仁、核体等多种结构，还包含遗传物质dna，在实际的细胞核悬液制备过程中，很难保证上述物质的完整性，现有技术中并未找到解决方式。然而，在新一代高通量单细胞测序平台中，有些情况只能将组织制备成细胞核悬液才能进行测序，如细胞体积过大的组织，高能耗伴随的多线粒体的组织等。

3、单细胞转录组测序技术(scrna-seq)是一种在单个细胞水平上对转录组进行高通量测序分析，从而揭示单个细胞内所有基因表达和细胞间异质性的技术。近年来，单细胞rna测序技术在单细胞水平上实现了对异质组织和器官基因表达模式的分析，更好的解决了传统研究中存在的细胞异质性问题，为细胞类型鉴定及罕见细胞类型发现、maker基因筛选、细胞发育轨迹探讨、细胞功能分析等提供了良好的解决方案，但是，scrna-seq对于器官或者固体组织制备的细胞悬液的细胞活性和细胞数目有着较高的要求，单细胞核rna测序技术(snrna-seq)的出现，则在很大程度上解决了以上问题，它不局限于新鲜的组织样本，适用于冰冻样本，另外对于一些直径较大不易被捕获到的脂肪细胞，神经元细胞等等，单细胞核测序是一个合适的选择。

4、肌肉，附着于骨骼或内脏，具备收缩能力的柔软的、有弹性的组织，现阶段研究已经相对较多，单细胞转录组无论是从解离方法还是数据指标，都相对稳定，但针对于前期部分已经冻存的样本而言，单细胞核解离可以很好适用于冻存样本，避免样本浪费的同时，也可以得到不同于单细胞解离的数据，单细胞rna测序在分析肌纤维时有点困难，但单细胞核rna测序可以关注分散在整个肌肉细胞中的多个细胞核。

5、目前报道的肌肉组织单细胞提取的方法，相对较多，但针对肌肉组织单细胞核提取的方法十分有限。

6、cn112662737a公开了一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用，其提供的制备方法包括组织处理破碎、重悬、离心、沉淀、重悬、细胞筛过滤、重悬离心，最后检测核浓度。该提供的动物细胞核悬液满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，有利于其进一步的推广应用。

7、cn115074310a公开了一种在同一肺脏样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法。还公开用于前述方法中的试剂盒。其具体步骤包括:(1)样本准备、(2)酶解、(3)分离、(4)悬液制备。所述技术方案提高了样本的使用效率，同时又能够挖掘更全面的生物学信息，解答更深层次的生物学问题，具有广泛应用前景。

8、cn116478917a公开了一种动物脂肪组织细胞核提取试剂盒及其制备方法和应用，所述动物脂肪组织细胞核提取试剂盒包括细胞核裂解液，所述裂解液中含有0.3～1mm梯度离心试剂、30～100mm柠檬酸、0.1～1mm dtt和0.1～1u/μl rna酶抑制剂，利用无核酸酶水进行配制；进一步还包括细胞核纯化液，所述细胞核纯化液中含有0.2～2％ bsa、0.5～2mmdtt、1～3u/μl rna酶抑制剂，利用dpbs进行配制。该试剂盒原材料易获得，价格低廉，试剂组分具有良好生物相容性，无有害成分，安全环保，适用于脂肪组织细胞核提取。该动物脂肪组织细胞核提取方法，简单易操作，得到的细胞核核膜完整、基因表达稳定，纯度高杂质少，可用于单细胞测序，具有良好的实际应用价值。

9、因此，开发一种动物肌肉组织细胞核提取的方法，同时可以适用于多个物种的肌肉组织的单细胞核提取，是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种动物肌肉组织细胞核的提取方法及其应用，以适用于多个物种的肌肉组织的单细胞核提取。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种动物肌肉组织细胞核的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：

4、(1)取肌肉组织与mnib细胞核提取液混合后，将肌肉组织剪碎进行提取，得到提取物；

5、所述mnib细胞核提取液包括表面活性剂、缓冲盐、dtt和抑制剂；

6、(2)将所述提取物进行过滤，所得滤液定容，得到提取液；

7、(3)将所述提取液进行离心i，所得沉淀重悬后再次离心ii，所得沉淀即为所述动物肌肉组织细胞核。

8、优选地，所述肌肉组织与mnib细胞核提取液的料液比为80-120mg/ml，例如可以为85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、100mg/ml、105mg/ml、110mg/ml、115mg/ml等。

9、优选地，所述肌肉组织剪碎至1-3mm3，例如可以为1.5mm3、2mm3、2.5mm3等。

10、优选地，所述提取时采用冰浴，时间为7-9min，例如可以为7.5min、8min、8.5min等。

11、优选地，所述提取时颠倒混匀2-5次/分钟，例如可以为2次/分钟、3次/分钟、4次/分钟、5次/分钟。

12、优选地，所述表面活性剂为triton x-100。

13、优选地，所述缓冲盐为pbs缓冲液和tris-hcl缓冲液。

14、优选地，所述抑制剂为rnase抑制剂。

15、优选地，所述mnib细胞核提取液中表面活性剂的质量百分含量为0.012％-0.013％，例如可以为0.0122％、0.0124％、0.0126％、0.0128％等。

16、优选地，所述mnib细胞核提取液中dtt的浓度为0.8-1.2mm，例如可以为0.85mm、0.9mm、0.95mm、1.0mm、1.05mm、1.1mm、1.15mm等。

17、优选地，所述mnib细胞核提取液中tris-hcl缓冲液的浓度为8-12mm，例如可以为8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、10.5mm、11mm、11.5mm等。

18、优选地，所述mnib细胞核提取液中rnase抑制剂的酶活浓度为180-220u/ml，例如可以为185u/ml、190u/ml、195u/ml、200u/ml、205u/ml、210u/ml、215u/ml等。

19、优选地，所述mnib细胞核提取液中的溶剂为pbs缓冲液。

20、优选地，所述mnib细胞核提取液的ph值为7.2-7.6，例如可以为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6等。

21、优选地，所述过滤的滤网孔径为30-40μm，例如可以为30μm、40μm等。

22、优选地，所述离心i、离心ii的转速各自独立地为500-700rcf(例如可以为520rcf、540rcf、560rcf、580rcf、600rcf、620rcf、640rcf、660rcf、680rcf等)，温度为4℃，时间各自独立地为4-6min(例如可以为4.5min、5min、5.5min等)。

23、优选地，所述定容、沉淀重悬采用的试剂为重悬buffer。

24、优选的，所述重悬buffer中包括4.5％-5.5％ pbsa(例如可以为4.6％、4.8％、5％、5.2％、5.4％等)和0.15-0.25u/ml rnase抑制剂(例如可以为0.16u/ml、0.18u/ml、0.2u/ml、0.22u/ml、0.24u/ml等)，溶剂为pbs缓冲液。

25、优选地，所述提取液与肌肉组织的体积质量比为(6-8)ml:100mg，例如可以为6.5ml:100mg、7ml:100mg、7.5ml:100mg等。

26、优选地，所述提取方法包括如下步骤：

27、(1)取肌肉组织与ph值为7.2-7.6的mnib细胞核提取液按照料液比为80-120mg/ml混合后，将肌肉组织剪碎至1-3mm3，进行冰浴提取7-9min，提取期间需颠倒混匀2-5次/分钟，得到提取物；

28、所述mnib细胞核提取液包括0.012％-0.013％ triton x-100、8-12mm tris-hcl缓冲液、0.8-1.2mm dtt和180-220u/ml rnase抑制剂，溶剂为pbs缓冲液；

29、(2)将所述提取物进行30-40μm过滤，所得滤液采用重悬buffer定容，得到提取液，所述提取液与肌肉组织的体积质量比为(6-8)ml:100mg；

30、所述重悬buffer包括4.5％-5.5％ pbsa和0.15-0.25u/ml rnase抑制剂，溶剂为pbs缓冲液；

31、(3)将所述提取液进行500-700rcf、4℃离心4-6min，所得沉淀采用重悬buffer重悬后再次500-700rcf、4℃离心4-6min，所得沉淀即为所述动物肌肉组织细胞核。

32、第二方面，本发明提供一种动物肌肉组织细胞核悬液，所述动物肌肉组织细胞核悬液中的动物肌肉组织细胞核采用第一方面所述的提取方法制备得到。

33、第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的动物肌肉组织细胞核悬液在构建单细胞转录组测序文库中的应用。

34、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

35、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

36、1、本发明所配制的mnib细胞核提取液可以在较短时间内从冷冻或新鲜肌肉组织中成功分离提取单细胞核，得到的细胞核状态较好，完整性相对较高，满足后期的rna seq研究，并且该提取细胞核的方法适用于多个物种的肌肉组织；

37、2、本发明提供的提取方法操作过程简单，方便，仅需0.5-1h即可完成，提供的细胞核悬液可以用于单细胞核测序实验，具有较高的商业应用价值。

38、3、本发明提供的提取方法中试剂组分简单且常见，成本较低。